Après des débuts au théâtre dans son pays natal, Kathleen Arthur épouse en 1924 l'acteur d'origine canadienne
Gene Lockhart (dont elle prendra le nom à la scène) et émigre alors aux États-Unis. Elle débute à Broadway (New York) en 1930, y interprétant au total quatre pièces, la dernière en 1945, toutes aux côtés de son mari.
Au cinéma, à partir de 1933, Kathleen Lockhart apparaît dans trente-huit films américains, dont plusieurs avec son époux. Devenue veuve en 1957, elle se retire définitivement après une ultime prestation à l'écran en 1959. Son avant-dernier film (sorti en 1954) est Romance inachevée, consacré à Glenn Miller, où elle interprète la mère du jazzman -- joué par
James Stewart --.
De son union avec Gene Lockhart, est née l'actrice
June Lockhart (elle-même mère d'
Anne Lockhart, également actrice).
Une étoile lui est dédiée sur le Walk of Fame d'Hollywood Boulevard.