Attiré depuis toujours par la comédie, Thomas Jane fait ses débuts de comédien sur les planches, notamment dans All My Sons d'Arthur Miller et La Ménagerie de verre du célèbre dramaturge Tennessee Williams. Il obtient ensuite des petits rôles dans The Crow et Volte/face puis dans Boogie Nights de Paul Thomas Anderson. En 1998, il incarne un soldat mourant aux côtés de Sean Penn dans
La Ligne rouge. Tous ces seconds rôles permettent à l'acteur d'être en tête d'affiche dans Peur bleue, un film d'horreur mise en scène par Renny Harlin, puis dans Magnolia où il retrouve Paul Thomas Anderson, film lauréat d'un Ours d'or à Berlin. Deux ans plus tard, il joue avec Gene Hackman et Monica Bellucci dans
Suspicion puis dans la comédie romantique Allumeuses!.
Après avoir joué dans Dreamcatcher, adapté d'un roman de Stephen King, malgré cette carrière, le grand public ne découvre véritablement l'acteur qu'en 2004, lorsqu'il incarne Franck Castle dans The Punisher, une adaptation du Comic Book Marvel. Malheureusement, il ne profite pas de l'occasion pour jouer et sa carrière fait une pause. En 2008, il est, pour la deuxième fois, un héros de Stephen King adapté par Frank Darabont dans le film d'épouvante The Mist.
Depuis 2009, il incarne le rôle principal de la série Hung produit par la chaîne HBO. Son personnage Ray Drecker est un entraineur de basket divorcé et père de deux adolescents qui se voit contraint de trouver un autre moyen de subsistance plus rémunérateur ; aidé par son anatomie avantageuse, il devient escort-boy.