Née à Dolton, dans l'Illinois, Jane Lynch est la fille d'une mère au foyer et d'un père banquier. Elle grandit dans sa ville natale. Elle a été élevée dans une famille catholique irlandaise et scolarisée à Thornridge High School. Elle a obtenu son baccalauréat en théâtre de l'Illinois State University et son MFA de l'Université Cornell, également dans le théâtre.
Elle débute au théâtre dans des troupes d'improvisations telles que The Second City, se faisant remarquer avec Oh My Sister, My Sister.
Bien qu'elle ait débuté au cinéma à la fin des années 1980, notamment avec les films Vice Versa et
Le Fugitif, ce n'est qu'en 2000 avec Bêtes de scène, de Christopher Guest, qu'elle se fait véritablement connaître du grand public, en incarnant un maître-chien lesbienne. Elle collaborera de nouveau avec Guest dans deux autres films : A Mighty Wind et For Your Consideration.
Elle apparaît également dans plusieurs séries télévisées comme The West Wing, Monk, The L Word, NewsRadio, JAG, Dawson et Desperate Housewives, ainsi que Mon oncle Charlie et Friends. Elle a fait une apparition remarquée dans Esprits criminels, où elle incarne la mère schizophrène de Spencer Reid. Elle décroche par la suite le rôle de Sue Sylvester dans la série Glee, recevant des critiques dithyrambiques pour son interprétation.
Au cinéma, elle incarne la patronne de Steve Carell dans 40 ans, toujours puceau (à noter que c'est
Nancy Walls, femme de Steve Carell, qui a suggéré Jane Lynch pour le rôle), la mère de Will Ferrell dans Ricky Bobby : Roi du circuit et la soeur de Meryl Streep dans Julie et Julia.
Depuis 2009, elle joue le rôle de Sue Sylvester dans la série musicale Glee. Sue est l'entraineuse des cheerleaders de l'école, entraineuse peu sympathique avec les membres du Glee Club.
Lynch, ouvertement lesbienne, a épousé le Dr Lara Embry le 31 mai 2010 au restaurant Blue Heron à Sunderland, dans le Massachusetts.