Dans les années 1950, il suit les cours de l'école de théâtre du Piccolo Teatro à Milan.
Il joue de nombreux rôles au cinéma à partir de 1959 et connaît son plus grand succès international avec son interprétation du personnage de Guy Foucher dans
Les Parapluies de Cherbourg, film qui passe presque inaperçu en Italie.
Nino Castelnuovo connaît cependant le succès populaire dans son pays à partir de son interprétation de Renzo dans I promessi sposi (RAI, 1967), d'après le roman de Manzoni (Les Fiancés).
Dans l'ensemble, il a surtout tourné pour la télévision. Il est aussi connu pour une prestation publicitaire de longue durée (1977-1982) pour la marque d'huile Cuore (Coeur).
Au cinéma, on peut citer quelques rôles :
En 1995, il apporte son témoignage dans le film d'Agnès Varda, L'Univers de Jacques Demy.