Rhona Mitra débute sa carrière d'actrice au milieu des années 90, après avoir pris des cours dans une école de théâtre fondée par
Judi Dench. Elle apparait à la télévision dans quelques séries dont Ghostbusters of East Finchley, The Bill et The Man Who Made Husbands Jealous. Elle joue également le rôle d'une prostituée dans le drame intimiste Monk Dawson, puis celui de la jeune princesse Sheherazade dans le film d'aventures A Kid in Aladdin's Palace aux côtés de
Thomas Ian Nicholas.
En 1997, Rhona est choisie par Eidos Interactive pour incarner le personnage de Lara Croft lors de la promotion du jeu vidéo Tomb Raider II. Entre diverses séances photos et interviews dans la presse, elle se fait connaître du public et obtient un grand succès auprès des fans du jeu vidéo. Elle prête même sa voix au personnage avec le single Lara Croft : Getting Naked, composé et produit par
Dave Stewart. Pressentie pour tenir le rôle au cinéma dans un premier projet de film, elle est pourtant renvoyée au bout de quelques mois.
Rhona Mitra décide ensuite de poursuivre sa carrière d'actrice aux États-Unis. Elle tient le principal rôle féminin du film Beowulf, aux côtés de Christophe Lambert, puis apparaît dans quelques épisodes de la série télévisée La vie à cinq. On la revoit ensuite au cinéma dans des rôles secondaires : voisine tentatrice de
Kevin Bacon dans Hollow Man, étudiante machiavélique de
Kevin Spacey dans
La Vie de David Gale, femme fatale dans
Le Nombre 23 aux côtés de
Jim Carrey, et agent du F.B.I dans
Shooter, tireur d'élite. Elle joue également aux côtés de
Jim Caviezel dans le thriller Highwaymen, la poursuite infernale, où elle est traquée par un maniaque de la route. Mais l'actrice connaît surtout un regain de notoriété avec son rôle de l'avocate Tara Wilson dans la série télévisée Boston Justice (ABC), ainsi que celui sulfureux de l'agent de police Kit McGraw dans la troisième saison de Nip/Tuck (FX Network). Rhona Mitra est également amenée à tenir des rôles principaux au cinéma : si elle tient la vedette du film fantastique Skinwalkers, c'est le personnage de la farouche Eden Sinclair dans le film d'anticipation
Doomsday (réalisé par
Neil Marshall), qui lui permet véritablement de s'imposer au cinéma. L'actrice incarne ensuite la vampire Sonja dans le film Underworld 3 : Le Soulèvement des Lycans, qui confirme son penchant pour le cinéma fantastique et les rôles musclés.