Fils d'un conseiller patrimonial et d'une galeriste, Stéphane Guillon est exclu de son lycée en seconde. Alors que ses parents l'ont inscrit dans une « boîte à bac » près de la gare Saint-Lazare, à Paris, il suit une formation de comédien, notamment les cours de théâtre de Jean-Laurent Cochet. De 17 à 35 ans, il tourne dans une dizaine de téléfilms où il ne réussit cependant pas à percer. Sa carrière d'humoriste débute en 1990 par un premier One-man-show.
En 1999 et 2000, il collabore à la chronique Fallait pas l'inviter avec
Michel Muller sur Canal+, insérée à l'émission Nulle part ailleurs, animée alors par Nagui.
Mais c'est en tant que chroniqueur qu'il devient connu du grand public. Il intervient en effet dans La Grosse Émission, sur Comédie !, en 2001-2002. Puis, après s'être fait remarquer sur scène dans son one-man-show Petites horreurs entre amis au festival d'Avignon en 2002 puis au Théâtre de la Main d'or de Dieudonné au printemps 2003, il rejoint Stéphane Bern à la radio dans l'équipe du Fou du roi, sur France Inter. Celui-ci lui propose de le suivre à la télévision, sur Canal+, dans son émission 20h10 pétantes, où il assure une chronique entre 2003 et 2005. Suite à l'arrêt de l'émission, il continue sur Canal+ avec
Thierry Ardisson dans Salut les Terriens à partir de 2006. À partir de janvier 2008, il tient une chronique intitulée « L'humeur de... » à 7h55 du lundi au mercredi dans Le Six trente dix sur France Inter. Après un certain nombre de polémiques, cette chronique est supprimée par Jean-Luc Hees à l'été 2010.
Il continue à mener en parallèle sa carrière d'humoriste sur scène, avec Liberté Surveillée, son dernier spectacle en date, ainsi que d'acteur au cinéma.
Le 6 décembre 2010, jour de ses 47 ans, il est le maitre de cérémonie de la soirée de clôture du festival de comédie de Montreux. Le spectacle, intitulé Même pas peur! Carte blanche à Stéphane Guillon est inédit et diffusé en direct sur France 4. Stéphane présente les sketchs d'humoristes dont il apprécie le talent comme
Jean-Marie Bigard, Jean-Luc Lemoine ou Stéphane Rousseau et de jeunes comédiens tels que Malik Bentalha, Eric Antoine et d'autres. Ces prestations sont émaillées de ses propres interventions caustiques. Cette soirée cartonne et regroupe plus d'un million de téléspectateurs, ce qui constitue la plus grosse audience de la soirée sur la TNT.
Depuis 2005, il vit en couple avec Muriel Cousin (divorcée de
Valery Zeitoun), chroniqueuse télé et radio, qui collabore à l'écriture de ses textes et le met en scène,.