Après avoir obtenu un baccalauréat A3 (philosophie et arts plastiques), Jean Dujardin débute dans la vie active en tant que serrurier mais c'est à l'armée, lors de son service militaire, qu'il voit ses talents de comique se révéler. Il se rend alors à Paris où il se produit dans des bars et petits théâtres. Quelques temps plus tard, il forme « la Bande du Carré Blanc » avec Éric Collado, Emmanuel Joucla, Éric Massot et Bruno Salomone qu'il avait rencontré dans le théâtre du même nom Le Carré Blanc. La troupe deviendra plus tard les Nous C Nous, et produira quelques spectacles ainsi qu'une parodie des boys bands très en vogue à l'époque, sous la forme d'une chanson éponyme, avant de participer régulièrement à l'émission Fiesta de Patrick Sébastien, diffusée sur France 2. Entre 1997 et 1998, ils gagnent à trois reprises l'émission de M6 : Graines de star dans la catégorie « comiques ».
Par la suite Jean Dujardin tourne avec Bruno Salomone, de petits sketches pour l'émission Farce Attaque, sur France 2.
D'octobre 1999 à juin 2003, il joue avec Alexandra Lamy dans la série télévisée à succès Un gars, une fille sur France 2. Les deux interprètent des personnages nommés comme eux Jean et Alexandra, alias Chouchou (elle) et Loulou (lui). La série compte 486 épisodes de moins de cinq minutes.
Son premier grand succès au cinéma est le film Mariages ! de Valérie Guignabodet en 2004.
Brice de Nice, l'adaptation au cinéma du personnage d'un de ses sketchs avec les Nous C Nous, sorti en 2005, est un succès au box-office et devient très populaire dans les cours d'école où la fameuse expression J't'ai cassé devient à la mode. Des goodies tels que jeu vidéo et sonnerie de téléphone portable se sont échangés par milliers. Il obtient une nomination au César du meilleur acteur en 2007 suite à sa prestation dans le film OSS 117 : Le Caire, nid d'espions. La suite, OSS 117 : Rio ne répond plus, est sortie en 2009.
Acteur touchant à tous les registres, il endosse des rôles à contre-emploi dans Contre-enquête et
99 francs dans lesquels il joue respectivement un policier enquêtant sur l'assassinat et le viol de sa jeune fille de 10 ans puis un publicitaire désabusé et dépressif dans l'adaptation du livre de Frédéric Beigbeder, 99 F.
En 2007, il devient producteur et réalisateur avec la série de programmes courts Palizzi proposée sur la chaîne 13ème rue avec dans le rôle principal Arsène Mosca. Devant le succès de la série, un film adapté du pilote de la série va être tourné.
En 2008, il joue aux côtés de Jean-Paul Belmondo auquel il est souvent comparé dans
Un homme et son chien de Francis Huster.
En 2009, il incarne Lucky Luke dans le
film du même nom de James Huth, aux côtés d'Alexandra Lamy, Sylvie Testud, Michaël Youn et Daniel Prevost.
En 2010, il incarne Charles Faulque dans Le Bruit des glaçons de Bertrand Blier, aux côtés d'Albert Dupontel, Anne Alvaro, Myriam Boyer et Audrey Dana. Il tourne également dans le film de Nicole Garcia, Un balcon sur la mer avec notamment Sandrine Kiberlain, Marie-Josée Croze, Michel Aumont et Claudia Cardinale où il joue le rôle de Marc, un homme qui retrouve son amour de jeunesse et mène une enquête lorsqu'elle disparaît. La même année, il apparait dans
Les petits mouchoirs de Guillaume Canet, dans lequel son rôle, bien que court, ouvre le film.
En 2009, Jean Dujardin s'engage aux côtés de Marc Lièvremont, sélectionneur du XV de France pour devenir le parrain de la Fondation Mouvement pour les Villages d'Enfants, qui accueille dans ses Villages et foyers d'accueil des enfants placés par décision de justice en raison de maltraitances ou de négligences graves.
Jean Dujardin a deux garçons (Simon en 2000 et Jules en 2001) nés de son union avec Gaëlle achevée en 2003.
Depuis 2003, il est en couple avec Alexandra Lamy, sa partenaire dans Un gars, une fille. Ils se sont mariés à Anduze, Gard le 25 juillet 2009, après 6 ans de vie commune.