Justin Randall Timberlake est né à Memphis, Tennessee, de Randall Timberlake et Lynn (née Bomar). Il appartient à une lignée anglaise. Son grand père paternel, Charles L. Timberlake , mari de Bobbye Joice, était un pasteur baptiste. Justin Timberlake a été éduqué sous l'Église baptiste, même s'il se considère lui-même plus « spirituel que religieux », bien que chrétien. Ses parents divorcent en 1985 et chacun se remarie : sa mère, qui travaille alors dans la compagnie de divertissement Just-in Time Entertainment, se remarie à Paul Harless, un banquier, quand Justin a 5 ans. Tandis que son père, directeur de chorale dans une église baptiste, a eu deux enfants, Jonathan (née en 1993) et Stephen (née en 1998) de son second mariage à Lisa Chwieseni. Sa demi-soeur, Laura, décède juste après sa naissance en 1997 et est mentionnée dans la chanson-hommage "My Angel in Heaven". Timberlake grandit à Millington, petite ville au nord de Memphis. Sa toute première tentative musicale se fait dans l'émission américaine Star Search sous le nom de « Justin Randall ».
En 1993, il rejoint le Mickey Mouse Club. Il y rencontre sa future petite copine et superstar de la pop Britney Spears, sa future coéquipière sur le Justified/Tripped Tour, la diva Christina Aguilera et son future partenaire de NSYNC JC Chasez.
Quand l'émission prend fin en 1995, Timberlake recrute Chasez pour faire partie du nouveau boys band, managé par Lou Pearlman, qui a déjà recruté Chris Kirkpatrick. Le groupe se fait appeler NSYNC.
NSYNC (ou 'N' Sync) se forme en 1995 et a débute sa carrière en 1996 en Allemagne. Le groupe atteint les États-Unis deux ans plus tard en sortant un album éponyme, puis un autre album à Noël 1998.
En 1999, Timberlake joue le rôle de Jason Sharpe dans le téléfilm Mannequin d'un jour.
Le 3e album de NSYNC, No Strings Attached, sort en 2000. Le 4e, Celebrity, voit le jour en 2001 et est suivi en 2002 par la tournée Celebrity Tour et la sortie du titre "Girlfriend" avec le rappeur Nelly. Le groupe décide alors de faire un break. Justin Timberlake commence à travailler sur son premier album solo. Concernant le management de Lou Pearlman, Timberlake déclarera le 24 septembre 2006 dans une interview au magazine Rolling Stone : « J'ai été momentanément trahi », en référence à l'important pourcentage (75%) que touchait Pearlman sur le boys band.
En 2002, on l'aperçoit, interprétant Elton John jeune, dans le clip de ce dernier "This Train Don't Stop There Anymore", extrait de Songs from the West Coast.
En août 2002, après plusieurs mois d'enregistrement en studio, Justin Timberlake donne un concert aux MTV Video Music Awards 2002, avec son tout premier single solo, "Like I Love You", une musique dance produit par The Neptunes. La chanson atteint la onzième place du Billboard Hot 100. Peu de temps après, Timberlake sort son tout premier album solo, Justified, le 5 novembre 2002. Alors qu'il termine une relation de 3 ans avec Britney Spears, l'artiste n'hésite pas à s'inspirer de celle-ci pour écrire des chansons parfois amères sur l'amour ("Cry Me A River"). L'album est également un grand succès, malgré les ventes considérables que le groupe NSYNC avait connues. Justified débute également à la deuxième place du Billboard 200 de vente d'album, se vendant à 439 000 exemplaires la première semaine. Finalement, l'album se vendra à plus de 3 millions d'exemplaires aux États-Unis et à plus de 7 millions à travers le monde. L'album reçoit également de très bonnes critiques, présenté comme une grande influence R'n'B, et soutenu par des producteurs de Hip-hop tel que The Neptunes et Timbaland. Justified a tourné sur les ondes tout au long de l'année 2002 et 2003, incluant les singles (classés dans le top 10) "Cry Me A River" et "Rock Your Body".
Timberlake soutient son album avec la tournée Justified/Stripped Tour au côté de Christina Aguilera pendant l'été 2003. Lors de quelques dates, les Black Eyed Peas feront l'ouverture du concert. Timberlake apparaît d'ailleurs sur leur tube "Where Is The Love?", sur leur album Elephunk qui sort en juin 2003. Sa société de production ne souhaite pas créditer Timberlake au titre, de peur de perturber la mise au point des futures chansons de Timberlake, même s'il apparait souvent aux côtés des Black Eyed Peas lors des performances live, dont les MTV Europe Music Awards 2003. En fin d'année, Timberlake enregistre une chanson intitulée "I'm Lovin' It", qui est utilisée par la société McDonald's pour leur thème de campagne publicitaire. L'entente entre McDonald's et le chanteur est estimée à 6 millions de dollars.
Le 1er février 2004, pendant la mi-temps du 38e Super Bowl, diffusé sur la chaîne américaine CBS, Timberlake chante en direct au côté de Janet Jackson devant plus de 140 millions de téléspectateurs. À la fin de la performance, Timberlake déchire une partie du costume en cuir de Janet Jackson, alors qu'il chantait au même moment « gonna have you naked by the end of this song » (« tu seras nue à la fin de la chanson »). Une partie du costume est donc décrochée, et le sein de Janet est temporairement dévoilé. Par la suite, Timberlake s'excusera de cet « incident de costume » (wardrobe malfunction) en disant qu'il était « désolé pour toutes les personnes qui ont été offensées par cet incident lors de la mi-temps du Super Bowl. Ce n'était pas mon intention et je le regrette ». Quelques jours plus tard, Timberlake, en direct de Los Angeles sur le plateau de KCBS-TV, avoue que même sa propre famille fut offensée par l'évènement. La phrase wardrobe malfunction est depuis utilisée dans les médias en référence à un incident, et est entré dans la culture populaire.
Après cette controverse, Justin Timberlake et Janet Jackson sont bannis des Grammy Awards 2004, à moins qu'ils présentent leurs excuses sur scène lors de l'évènement. Janet Jackson, qui a déjà fait des excuses publiques, décline cette solution. Timberlake, lui, « s'accompagne » d'une lettre d'excuse lorsqu'il reçoit l'un de ses deux grammy awards de la soirée (Meilleur album pop : Justified, et meilleur musique pop : "Cry Me A River"). Il y était également nommé pour l'album de l'année pour Justified, de la musique de l'année pour "Cry Me A River" et de la meilleure collaboration rap pour "Where Is The Love?" avec The Black Eyed Peas.
Après la controverse du Super Bowl, Timberlake met sa carrière musicale de côté, pour se lancer dans une carrière cinématographique. Durant cette période, il joue un jeune journaliste dans le thriller
Edison, directement sorti en DVD en 2005. Il apparait également dans les films Alpha Dog,
Black Snake Moan, Southland Tales du réalisateur Richard Kelly et prête sa voix au jeune Roi Arthur dans le film d'animation Shrek le troisième, sorti en mai 2007.
Timberlake continue de travailler avec d'autres artistes. Après "Where Is The Love ?", il collabore une seconde fois avec les Black Eyed Peas en 2005 sur "My Style" paru sur l'album Monkey Business. De plus, Timberlake apparait au côté de Nelly, sur le single "Work It", qui avait été remixé et inclut sur l'album remix de Nelly en 2003, Da Derrty Versions: The Reinvention. Lors de l'enregistrement du single "Signs" en 2005 avec Snoop Dogg, Timberlake se découvre un problème de gorge. Des nodules ont été postérieurement déplacés de sa gorge, lors d'une opération ayant lieu le 5 mai 2005. Il lui est alors conseillé de ne pas chanter, et de ne pas parler trop bruyamment pendant plusieurs mois. Lors de l'été 2005, Timberlake lance son propre label, Tennman Records.
En 2005, Justin Timberlake et son meilleur ami Trace Ayala créent leur propre ligne de vêtement nommée William Rast. Pour le nom, les deux amis n'hésitent pas : « On a juste pensé aux deux personnes qui ont le plus influencé nos vies, c'est-à-dire nos grands-pères », explique Justin. « William est le nom de mon grand-père et Rast celui du grand-père de Trace. Assemblez-les et voilà. »
Timberlake fait une apparition dans le clip "Promiscuous" de Nelly Furtado et Timbaland. Il sort son second album solo FutureSex/LoveSounds le 12 septembre 2006. L'album, que Timberlake a enregistré en studio à partir de 2005, débute directement à la première position du classement Billboard 200, se vendant à 684 000 exemplaires dès sa première semaine. L'album détient le record de pré-ventes sur iTunes, et bat le record de Coldplay de l'album numérique le plus vendu en une semaine. FutureSex/LoveSounds a été produit par Timbaland, Danja, Will.I.Am, Rick Rubin et Timberlake lui-même, mélangeant ainsi plusieurs styles musicaux (pop, danse, rap, funk, ...). Il contient plusieurs collaborations, tels que Three 6 Mafia, T.I. et Will.I.Am. Le studio représentant l'album le décrit comme une « connaissance de l'érotisme » et ciblant de « fortes sensations charnelles ». Cet album demeure le plus vendu de 2006/2007.
Le 1ersingle de l'album, "SexyBack", est diffusé pour la première fois durant la performance publique de Timberlake lors de l'ouverture des MTV Video Music Awards 2006 et s'installe directement à la première place du Billboard Hot 100 américain, tout comme le troisième single "What Goes Around...Comes Around". La chanson est connue pour avoir mis en avant la rupture de son ami d'enfance et co-créateur de William Rast, Trace Ayala, avec l'actrice Elisha Cuthbert.
En octobre 2006, Timberlake déclare qu'il ne délaisse pas sa carrière musicale au profit de celle d'acteur, précisant que cet abandon serait une « chose idiote à faire ». Il est l'invité spécial de la soirée mode de Victoria's Secret en 2006, pour son interprétation de "SexyBack".
En janvier 2007, il débute sa tournée FutureSex/LoveShow. "Summer Love" est le quatrième single de l'album, alors que le suivant en Europe est "LoveStoned". Il participe aussi à la chanson Give It To Me, extrait de l'album Shock Value de Timbaland, au côté de Nelly Furtado, atteint la première place du Billboard Hot 100 américain.
Après sa tournée, il fait appel à des grands noms du Hip-hop et du R'n'B comme Missy Elliott, 50 Cent et Beyoncé Knowles pour des remixes produits par le DJ Pro Wayne Williams Ol Skool, qui figurent sur l'Édition Deluxe de FutureSex/LoveSounds. Les titres comme "Until The End Of Time", "Sexy Ladies" et "SexyBack" sont remis au goût du jour par ces artistes contemporains qui rencontrent un énorme succès national et mondial. Durant l'été 2007, Justin enregistre à Londres plusieurs morceaux avec Madonna. Au final cinq morceaux qu'il a co-écrit se retrouveront sur l'album Hard Candy, dont le duo 4 Minutes qui est un succès partout dans le monde.
Dans son clip "What Goes Around...Comes Around", l'actrice Scarlett Johansson joue le rôle de sa petite amie qui le trompe. Ce clip est alors un grand succès et on suspecte le jeune Timberlake de côtoyer la belle actrice.
Grand fan de golf, il signe un contrat de 5 ans avec la PGA (l'Association des Golfeurs Professionnels]) pour animer des tournois et jouer avec les meilleurs joueurs du monde.
Le 16 décembre 2006, Justin Timberlake montre ses qualités humoristiques, lors d'un épisode la célèbre émission Saturday Night Live, dont il est l'invité d'honneur. Il y effectue des sketchs hilarants, dont le clip "Dick In A Box", en duo avec Andy Samberg et produit par The Lonely Island, où ils parodient les chanteurs de RnB très "lovers" des années 1990. La parodie a tellement marqué que le titre est diffusé sur des radios américaines et britanniques et connait un très grand succès sur YouTube. Cette vidéo a même eu une suite, "Motherlover", le 9 mai 2009. Entre temps, Justin Timberlake a fait de nombreuses autres apparitions dans le Saturday Night Live.
En novembre 2007, Timberlake entre dans la légende. En effet "Until The End Of Time", sixième extrait de l'album FutureSex/LoveSounds entre dans le Top 40 aux États-Unis. Seul Michael Jackson avait réussi cette performance auparavant, à savoir placer 7 singles d'un même album dans le Top 40 (Thriller, Bad et Dangerous). C'est donc une très bonne marque de réussite pour Justin Timberlake.
Dès 2008, les Parfums Givenchy annonce leur partenariat avec le chanteur pour le parfum Play.
À partir de 2008, Justin s'offre une pause dans sa carrière musicale en solo, pour se consacrer entièrement à ses autres passions. Il s'investit dans sa marque de vêtements William Rast, produit les artistes de son label Tennmann Records (Esmée Denters et Matt Morris) ainsi que Ciara, Leona Lewis, Rihanna, Sheryl Crow, Torpedo, Jamie Foxx, Game etc.
Il privilégie aussi sa carrière cinématographique, en multipliant les films. Après avoir joué quelques années plus tôt dans des films comme Alpha Dog et
Black Snake Moan, David Fincher lui offre en 2010 le rôle de Sean Parker, co-créateur de Napster et co-propriétaire de Facebook, dans The Social Network. Le film rencontre un franc succès.