Passionné de bande dessinée, il réalise à onze ans en 1980 avec son ami d'enfance Andre Bilejic son premier court-métrage Dark Empire, tourné en Super 8. Trois ans plus tard, il réalise un second court-métrage : Nuclear Memories. Ces débuts sont déjà marqués par la griffe du futur réalisateur : des scénario de science-fiction innovants et de surprenantes unhappy end (fin non heureuse dans un film, caractéristique de certaines série Z fantastiques).
Il entre à l'école de cinéma Ryerson Polytechnic Institute au Canada, qu'il quitte un an et demi plus tard. Il est ensuite embauché comme technicien de production, puis devient storyboarder aux Nelvana Animation Studios, travaillant sur les séries animés Babar, Tintin, Beetlejuice et Dog City. Durant cette période, il réalise deux autres courts métrages (Mouth & Playground), tous deux diffusés dans divers festivals internationaux. Il continue son travail de storyboarder désormais pour le cinéma (Boulevard en 1994, Blood & Donuts, Johnny Mnemonic en 1995, The Boys Club en 1997, Ginger Snaps en 2000).
En 1996, Vincenzo Natali est admis au Canadian Film Center's Resident Program. C'est dans ce cadre qu'il réalise son court-métrage Elevated. Il propose avec son ami Andre Bijelic le scénario de
Cube au nouveau département du Film Center, le Feature Film Project. Son projet, à la fois original et économique, est retenu par le jury qui lui permet d'entreprendre sa production. Le film remporte un franc succès et est récompensé dans divers festivals : Genie Awards en 1997 (5 nominations), Sundance Film Festival en 1997 (nomination), Toronto Film Festival en 1997 (meilleur premier film canadien), Festival de Gérardmer en 1999 (grand prix, prix du public, prix de la critique).
Quelques années et propositions plus tard, il accepte de réaliser son second film, basée sur un scénario de Brian King, Cypher. L'originalité du projet rend la recherche de financement difficile, mais le pari est relevé par la société de production Pandora Film spécialisée dans le cinéma indépendant. Comme pour son précédent film, Vincenzo Natali doit composer avec un petit budget (dix millions de dollars) et une période de tournage écourtée (trente-cinq jours). On retrouve dans ce film son acteur et ami d'enfance David Hewlett, qu'il avait connu à la St. George's College Choir School de Toronto.
Taxé d'être un réalisateur de films trop "intellectuels", il réalise en 2003 le surprenant film Nothing. Entre comédie et fantastique, ce troisième long-métrage démontre une nouvelle fois l'indépendance du réalisateur-scénariste. Dans l'attente d'un quatrième film, Vincenzo Natali réalise un documentaire sur le travail du réalisateur Terry Gilliam (Getting Gilliam) et participe l'année suivante au film collectif Paris, je t'aime.
Il fut le réalisateur de la première saison de la série télévisée Psi Factor en 1996, ainsi que de trois épisodes de la deuxième saison de la série télévisée Earth : Final Conflict (Payback, Friendly Fire, Isabel) en 1998. Il joue le rôle de Marcus Fiehls dans le film d'horreur Rip Cage en 2004.