Né William Franklin Beedle Jr à O'Fallon dans l'Illinois, aîné de trois enfants, il est le fils d'une institutrice, Mary Blanche, et d'un chimiste industriel, William Franklin Beedle Sr. La famille déménage en Californie quand il a trois ans. Diplômé de l'école South Pasadena, il entre au Pasadena Junior College pour continuer ses études scientifiques, où il s'implique dans la radio locale. Contrairement à la légende, il n'a pas étudié à la Pasadena Playhouse et n'a pas été repéré dans une pièce de théâtre qu'il y jouait.
Il part à New York avec un ami, laissant tomber ses études pour suivre les mêmes traces que son père, et débute à Broadway grâce à Bob Ben Ali dans Manya. A 20 ans, il joue un personnage qui en a soixante de plus. Il est alors repéré par Milton Lewis, un chasseur de talents au service de la puissante Paramount Pictures, qui lui offre un contrat pour six mois. Après un petit rôle dans Three faces east, il obtient un rôle de tout premier plan aux côtés de Barbara Stanwyck dans L'Esclave aux mains d'or (Golden Boy). Son rôle de violoniste devenu boxeur le fait remarquer pourtant il va par la suite enchaîner des rôles dans des productions mineures de la Paramount Pictures et de Columbia Pictures. Pendant la Seconde Guerre mondiale, il sert comme lieutenant dans l'armée de l'air, et épouse Brenda Marshall la même année. Il continue à tourner des films toutes ces années, et devient père de deux enfants : Peter et Scott.
Il renoue avec le succès grâce à Billy Wilder qui l'engage pour le légendaire Boulevard du crépuscule. Son rôle, à contre emploi, de scénariste malchanceux lui vaut une nomination à l'Oscar du Meilleur Acteur. Le film est aujourd'hui considéré parmi les plus grands films de l'histoire du cinéma. Il s'impose en star populaire l'année suivante dans Comment l'esprit vient aux femmes avec Judy Holliday. Deux ans plus tard, fort de sa nouvelle renommée, il tourne dans
Stalag 17 du même réalisateur. Cette fois, c'est la consécration et il obtient l'Oscar du Meilleur Acteur. Sa popularité grandit, notamment auprès des femmes. Il est élu Star "Masculine la plus populaire de l'année" aux Photoplays Award en 1954 et 1955.
Cette année-là il tourne La Tour des ambitieux de Robert Wise où il retrouve Barbara Stanwyck. Il remporte, avec le reste de la distribution, le prix spécial du jury au Festival de Cinéma de Venise en Italie. Le tournage de
Sabrina est plus difficile : il ne supporte pas Humphrey Bogart et tombe amoureux d'Audrey Hepburn. Celle-ci n'envisage pas de relation plus durable avec Holden qui est déjà marié et qui a subi une vasectomie qui l'empêche d'avoir des enfants, souhait le plus cher de l'actrice.
Sa réputation d'homme à femmes ne s'effrite pas avec ses rôles suivants : il côtoie Grace Kelly par deux fois dans Une fille de la province et Les Ponts de Toko-Ri, Kim Novak dans Picnic en 1955 et Sophia Loren dans La Clé. William Holden continue de briller dans des productions viriles qui ne font que contribuer à son succès international : il reprend le rôle refusé par Cary Grant dans Le Pont de la rivière Kwaï de David Lean en 1957, dont le succès est tel qu'il lui assure assez d'argent jusqu'à la fin de ses jours, et il est un médecin opposé à John Wayne dans
Les Cavaliers de John Ford.
Lors d'un voyage en Afrique, il tombe amoureux du Kenya. Il réinvestit une partie de l'argent gagné sur Le Pont de la rivière Kwaï dans l'achat d'un Ranch, qui devient une réserve naturelle (une fondation qui porte son nom existe aujourd'hui). Il n'abandonne pas le chemin des studios et continue à tourner dans des grandes productions hollywoodiennes. En 1964, il retrouve péniblement Audrey Hepburn pour Deux têtes folles : « J'ai réalisé que j'allais être obligé de revoir Audrey et de prendre en main mon problème d'alcool, or je ne me sentais pas capable d'affronter ni l'une ni l'autre de ces situations. ». La liaison qu'il vit avec Capucine, un ancien mannequin, n'arrange pas les choses. Il arrive souvent ivre sur le tournage, et doit même s'arrêter de tourner quelques jours.
Il est de Casino Royale en 1967, renoue avec le film de guerre l'année suivante pour La Brigade du diable de Andrew V. McLaglen mais c'est surtout le film de Sam Peckinpah, La Horde sauvage qui semble être le point culminant de cette fin de carrière. Le film, qui met aussi en scène Ernest Borgnine et Warren Oates est un classique du western. Dès lors, il freine sa carrière.
Il apparaît aux côtés de Bourvil dans L'Arbre de Noël, Breezy de Clint Eastwood et dans un classique du film catastrophe, La Tour infernale en 1974 avec Paul Newman et Steve McQueen.En 1976, il tient le rôle principal dans "Network" de Sydney Lumet aux côtés de Faye Dunaway, un de ses derniers grands rôles. Il joue également avec Newman en 1980 : Le Jour de la fin du monde. Son dernier film est S.O.B. de Blake Edwards aux côtés d'un grand nombre de vedettes, dont Julie Andrews.
Alcoolique notoire de longue date, William Holden n'a jamais réussi à surmonter son problème et connaît une fin tragique : ivre, il fait une chute qui l'empêche d'appeler du secours. Il est retrouvé mort le 16 novembre 1981 dans sa villa de Santa Monica. Sa dépouille est incinérée et ses cendres sont dispersées dans l'Océan Pacifique. Quelques mois plus tard, Barbara Stanwyck en recevant son Oscar d'Honneur lui rendit hommage, en déclarant : « Je l'aimais beaucoup et il me manque. Il a toujours souhaité que j'aie cet Oscar. Alors ce soir, mon Golden Boy, ton voeu se réalise ».