Ses premiers contacts avec le cinéma ont lieu en 1955 à Venise, durant la Biennale, au cours d'un voyage qui lui a été offert après qu'elle a gagné, à dix-sept ans, l'élection de « la plus belle italienne de Tunis ». Cependant, désirant être institutrice, elle décline toutes les propositions qui lui sont faites et ne fait qu'une brève apparition dans un court métrage, Anneaux d'or de René Vautier.
Ses véritables débuts dans un long métrage se feront en 1958 dans Goha de Jacques Baratier et surtout Le Pigeon de Mario Monicelli, sous l'égide du producteur Franco Cristaldi qu'elle épousera en 1966. Dans les années 1960, on la retrouve à l'affiche de nombreux succès critiques et publics. De célèbres réalisateurs vont se disputer sa présence devant leurs caméras. Ce sont Mauro Bolognini, Abel Gance, Luchino Visconti, Henri Verneuil, Philippe de Broca, Luigi Comencini, Federico Fellini, Blake Edwards, Henry Hathaway, ou Sergio Leone.
À cause de sa voix rauque et de son italien approximatif, l'actrice était systématiquement doublée dans ses films jusqu'à Huit et demi. Dans la version italienne originale du film Le Guépard, elle est doublée par Solveyg D'Assunta. Sur le tournage, Cardinale parlait français dans les scènes avec Alain Delon, anglais avec Burt Lancaster et italien par ailleurs.
Sa présence aux côtés d'Alain Delon dans Rocco et ses frères et dans Le Guépard de
Visconti, et aux côtés de Jean-Paul Belmondo dans
Cartouche la font connaître du public français, alors que le succès aux États-Unis et une renommée internationale lui viennent en 1963 de Huit et demi de Federico Fellini puis, en 1964, du film Le Plus Grand Cirque du monde d'Henry Hathaway, confirmés en 1969 par Il était une fois dans l'Ouest de Sergio Leone.
Les années 1970 et 1980 la voient alterner les rôles :
- Réalisations italiennes avec Marco Ferreri, Luigi Comencini, Franco Zeffirelli, Marco Bellocchio, Luchino Visconti (avec qui elle a joué quatre fois) et surtout son mari, le producteur Pasquale Squitieri.
- Réalisations françaises avec Christian-Jaque, José Giovanni, Michel Lang, Nadine Trintignant, Diane Kurys ou Robert Enrico.
- Réalisations internationales avec Jerzy Skolimowski, Mikhaïl Kalatozov, George P. Cosmatos, Alan Bridges, Werner Herzog ou Blake Edwards (pour Le Fils de la panthère rose, 30 ans après le premier rôle).
À partir de la fin des années 1990, elle tourne moins, se consacrant davantage au théâtre ou à l'écriture. En 1993, elle est membre du jury pour la sélection officielle des longs métrages au Festival de Cannes. Dans les années 2000, elle monte sur scène à Paris, interprétant, en 2000, La Vénitienne (anonyme du XVIe siècle) et Doux oiseaux de jeunesse de Tennessee Williams en 2005.
Elle a toujours adopté des positions politiques marquées par des idées libérales. De gauche, elle s'est souvent battue pour des causes concernant les droits des femmes et des homosexuels. Elle a apporté sa contribution à nombre de causes humanitaires. En 1999, l'UNESCO l'a désignée Ambassadrice de bonne volonté. « J'ai été une star, très jeune. Je n'ai pas de mérite, le destin en a décidé ainsi. Une étoile a toujours veillé sur moi ». Cette phrase est extraite de son livre autobiographique, paru le 20 janvier 2005, Mes étoiles, aux éditions Michel Lafon.
En 2009, elle publie Ma Tunisie aux éditions Timée, un livre de photos sur les traces de son enfance tunisienne.