David Strathairn suit les cours de comédie du Williams College, ayant pour camarade le réalisateur John Sayles, qui le fera tourner dans plusieurs films. Une fois diplômé, il s'engage en Floride dans une troupe de cirque ambulante et part sur les routes pendant six mois. Quand il arrive à New York, Strathairn joue plusieurs années au théâtre.
John Sayles lui fait démarrer sa carrière cinématographique dans Return Of The Secaucus Seven (1980). Sayles lui offrira par la suite de nombreux rôles dans Matewan (1987), Les Coulisses de l'exploit (1988), avec John Cusack et Charlie Sheen, City of Hope (1991) et Passion Fish (1992), film qui le fait révéler par la critique et le public. Il retournera avec Sayles en 1998 dans Limbo.
Toujours en 1992, il apparaît la même année dans Une équipe hors du commun avec Tom Hanks et Les Experts avec Robert Redford et Sidney Poitier.
David Strathairn est apparu dans plusieurs films dans les années 1990 : frère d'un avocat incarné par Tom Cruise dans
La Firme (1993) de Sydney Pollack, mari de Meryl Streep aux prises à des malfaiteurs aux cours de vacances en rafting dans La Rivière sauvage (1994), de Curtis Hanson, qu'il retrouvera trois ans plus tard dans l'oscarisé L.A. Confidential où Strathairn incarne le milliardaire Pierce Patchett.
Il apparaît aussi au générique de Dolores Claiborne de Taylor Hackford, en incarnant le mari de Kathy Bates et le père de Jennifer Jason Leigh en 1995.
Le réalisateur français Élie Chouraqui lui fait interpréter un grand photographe couvrant un reportage dans la Yougoslavie en guerre dans Harrison's Flowers, avec Andie MacDowell, qui interprète son épouse.
Pour sa seconde réalisation, George Clooney lui confie le rôle principal du film Good Night and Good Luck, celui du journaliste Edward R. Murrow, qui lui vaut le prix du Meilleur Acteur lors de la 62eMostra de Venise et nommé à l'Oscar du meilleur acteur.
Après des apparitions dans la série Les Soprano, l'acteur tourne dans le film My Blueberry Nights de Wong Kar-wai, où il interprète un alcoolique.
Récemment il a tourné dans les thrillers
La Faille de Gregory Hoblit, le dernier volet de la saga Jason Bourne (La Vengeance dans la peau) et le film fantastique Les Chroniques de Spiderwick.