Jean Arthur est née Gladys Georgianna Greene à Plattsburgh (New York) de Johanna Augusta Nelson et Hubert Sidney Greene. Elle avait trois grands frères. Ses grands-parents maternels étaient des immigrants originaires de Norvège qui s'installèrent dans l'Ouest américain.
Elle grandit dans les alentours de Westbrook dans le Maine de 1908 à 1915 quand son père travaillait aux studios Lamson à Portland comme photographe. Produit d'une enfance nomade, elle vécut également à Jacksonville en Floride; à Schenectady dans l'État de New York; et, à l'époque du lycée, dans le quartier de Washington Heights à Manhattan. Elle aurait inventé son nom de scène à partir de ses deux héros Jeanne d'Arc et le Roi Arthur.
Présageant nombre de ses rôles ultérieurs, elle travailla comme sténographe à Bond Street dans Manhattan pendant la Première Guerre mondiale.
Découverte par la Fox alors qu'elle posait pour des publicités à New York au début des années 1920, Jean Arthur fit ses débuts dans le film muet
Cameo Kirby (1923), réalisé par John Ford, puis dans des westerns à petit budget et quelques courts-métrages de comédie. Elle fut choisie comme l'une des WAMPAS Baby Stars en 1929, mais elle resta cantonnée au rôle de l'ingénue. C'est sa voix particulière et profonde - en plus de sa formation sur la scène à Broadway au début des années 1930 - qui lui permit de faire d'elle une vedette dans les films parlants.
En 1935, à l'âge de 34 ans, elle apparaît face à
Edward G. Robinson dans la farce de gangsters
Toute la ville en parle, également sous la direction de Ford, un rôle qui la rendit populaire. À cette époque, ses cheveux naturellement bruns au cours de ses apparitions dans le cinéma muet, sont teints en blond et le resteront jusqu'à la fin de sa carrière. À l'instar de
Claudette Colbert, elle était connue pour manoeuvrer de telle sorte à être toujours filmé et photographié exclusivement à sa gauche; les deux actrices considéraient ainsi que le côté gauche montrait leur meilleur profil et travaillèrent dur pour le mettre en permanence en avant. En fait, le producteur
Harry Cohn aurait décrit ainsi Jean Arthur : « un côté ange, de l'autre cheval ».
Le tournant décisif de sa carrière survient avec
Frank Capra qui la choisit pour le premier rôle féminin dans L'Extravagant Mr. Deeds. Capra l'avait remarqué dans le film Whirlpool en 1934 et avait convaincu
Harry Cohn, le patron de la Columbia de la signer pour un rôle de journaliste de caractère tombant amoureuse d'un plouc millionnaire. Dans les années 1930, Arthur sera à l'affiche de trois grands films de
Capra : son rôle aux côtés de
Gary Cooper en 1936 dans Mr. Deeds Goes to Town ont fait d'elle une star, confirmée par Vous ne l'emporterez pas avec vous (1938) et Mr. Smith au Sénat en 1939, tous deux face à
James Stewart. Elle joue à nouveau avec Cooper, en interprétant Calamity Jane dans
Une aventure de Buffalo Bill (1936) de Cecil B. DeMille, et joue une employée de bureau, son rôle le plus courant, avec
Ray Milland dans la comédie La Vie facile de
Mitchell Leisen. Sa popularité était alors telle qu'elle fut l'une des quatre finalistes pressenties pour le rôle de Scarlett O'Hara dans Autant en emporte le vent; le producteur du film,
David O. Selznick, eut une brève relation avec elle à la fin des années 1920, à l'époque où ils travaillaient tous les deux pour Paramount Pictures.