Astin est né à Baltimore, au Maryland, fils de Margaret Linnie (née Mackenzie) et Dr Allen Varley Astin, qui a été le directeur de la National Bureau of Standards (maintenant The National Institute of Standards and Technology) . Il a été de la promotion de 1952 à l'Université Johns-Hopkins, après un séjour au Washington & Jefferson College. C'est là qu'il a étudié en mathématiques avant d'entreprendre une Majeure en Arts Dramatiques à Johns Hopkins, où il a également été membre de la Fraternité Phi Kappa Psi.
Astin a commencé dans le théâtre, effectuant des voix hors-champ pour des films publicitaires. Sa première grande chance est venue dans un petit mais mémorable rôle dans
West Side Story, récompensée aux Oscars, en 1961. En 1962-1963, il a tenu le premier rôle dans les sitcom I'm Dickens, He's Fenster avec Marty Ingels, qui n'a duré qu'une saison, avec 31 épisodes. De 1964 à 1966, il a tenu le premier rôle dans La Famille Addams (The Addams Family) sous les traits du personnage de Gomez Addams, le macabre chef de famille.
Il est revenu à l'émission de télé La Nouvelle famille Addams (The New Addams Family) sous les traits de Grandpapa Addams, aux côtés de son successeur Glenn Taranto, dans le rôle iconique de Gomez.
Astin a également joué le Sphynx (Riddler) dans l'émission Batman après le départ de Frank Gorshin pour la deuxième saison (Gorshin est revenu à la troisième saison). Il a également fait une apparition remarquée dans la série télévisée de mystère Murder She Wrote (Elle écrit au meurtre, au Québec ; Arabesque en France), en tant que le vilain shérif Harry Pierce. Il a eu un rôle périodique dans l'émission de télé américaine Night Court sous les traits de Buddy, ancien patient psychiâtrisé et excentrique beau-père du personnage principal, le juge Harry Stone. De façon régulière, on l'a également vu jouer le rôle de Ed LaSalle dans le bref sticom Mary de Mary Tyler Moore, pendant la saison 1985-86.
Astin a reçu une nomination de prix de l'Académie pour Prélude, un court-métrage qu'il a écrit, produit, et dirigé. Il a été nommé pour le Ace Award pour son travail à l'émission Les Contes de la crypte (Tales from the Crypt), et a reçu une nomination Emmy pour la voix de Gomez dans la version en dessins animés de La Famille Addams, produits par la chaîne ABC-TV. Il a également fait la voix du personnage Bull Gator dans la série animée Taz-Mania, le diable de Tasmanie (Taz-Mania). Astin a siégé pendant quatre ans au Conseil d'Administration de la Guilde des Auteurs Américains (Writers Guild of America), et a été actif dans les actuvités communautaires de Los Angeles et de Santa Monica.
Il a continué à travailler en tant que comédien, apparaissant dans la série de films des Tomates Tueuses ( Killer Tomatoes) sous les traits du professeur Gangreen et comme un autre professeur dans The Adventures of Brisco County Jr.. Il également joué dans la tounée du spectacle Edgar Allan Poe : Il était une fois minuit (Edgar Allan Poe: Once Upon a Midnight), écrit par Paul Day Clemens et Ron Magid. Dans une entrevue accordée au journal le Baltimore Examiner, en décembre 2007, Astin résume ainsi son expérience de comédien : « Nous luttons tous (pour notre survie), et ce fut souvent mon cas, mais, (en fin de compte) j'ai a eu beaucoup de plaisir. J'ai participé à des centaines d'émissions de télé et tourné dans 30 à 40 films et j'aime jouer. Je suis tout particulièrement content d'avoir participé à la pièce sur Poe. Ça a été fantastique. »
Astin enseigne actuellement le système Stanislavski (method acting and directing) lors de conférences sur l'écriture dramatique à l'Université Johns-Hopkins, son alma mater. En commentant sa double carrière, il a déclaré, en 2007 : « Je ne connais pas une seule université d'importance qui ait un acteur connu comme enseignant, au quotidien.»; Il espère rétablir une Majeure en Arts Dramatiques à l'université, en faisant remarquer qu'il est un des rares à avoir obtenu un diplôme en Arts Dramatiques à Hopkins.
John Astin a cinq fils, dont trois (David, Allen, et Tom) de sa première épouse, Suzanne Hahn, et deux (Sean Astin et Mackenzie Astin) de sa deuxième épouse, l'actrice Patty Duke. John a légalement adopté Sean à son mariage avec Patty. John Astin est actuellement marié à Valerie Ann Sandobal et vit à Baltimore.
Son jeune frère, Alexandre Astin, est un professeur émérite à l'Université de Californie à Los Angeles (UCLA). Il a cinq petites-filles - Alexandra, Elizabeth, Isabella, Sedona et Jaya.