D'origine irlandaise et allemande, Katherine Heigl est la cadette des cinq enfants de Nancy et Paul Heigl (avec Meg, Jason, Holt et John Heigl). En 1986, un de ses frères meurt dans un accident de voiture. Cet évènement dramatique va profondément bouleverser l'équilibre familial et mener au divorce de ses parents quelques années plus tard.
Elle grandit selon la tradition des Mormons en Virginie, puis à Denver avant que la famille emménage à New Canaan dans le Connecticut.
Alors qu'elle est âgée de dix-neuf ans, une tante envoie des photos d'elle à diverses agences de modèles, et Katherine est rapidement engagée en tant que mannequin, notamment pour des catalogues de vente par correspondance, puis dans une publicité télévisée pour les céréales Cheerios. Ses mensurations étaient de 1,75 m pour 58 kilos.
Le 17 septembre 2009, Katherine adopte une petite fille, Naleigh Kelley.
Elle obtient un premier rôle d'actrice au cinéma dans le film That Night, en 1992 (notamment aux côtés d'Eliza Dushku) puis dans
King of the Hill de Steven Soderbergh l'année suivante. En 1994, elle obtient son premier grand rôle en reprenant le rôle de Marie Gillain dans My Father, ce héros, le remake américain du film Mon père, ce héros, face à Gérard Depardieu. Tout en poursuivant sa carrière de mannequin (elle apparaît régulièrement dans des magazines pour ados, comme Seventeen) et ses études, elle est à l'affiche de Piège à grande vitesse, avec Steven Seagal, en 1995 -- qui lui permet d'être invitée dans les shows de Jay Leno et Conan O'Brien --, puis d'un « Disney Channel Original Movie », L'étoile filante, en 1996.
En 1997, suite au divorce de ses parents et ses études terminées, elle part vivre avec sa mère à Los Angeles et celle-ci devient son agent. Elle tourne alors dans des films indépendants : Prince Vaillant, Stand-ins et Bug Buster. En 1998, elle apparaît dans un épisode de New York police judiciaire, puis elle joue le rôle de Jade dans La Fiancée de Chucky et enchaîne avec le téléfilm La Tempête, une transposition de la pièce de William Shakespeare pendant la Guerre de Sécession, dans laquelle elle joue aux côtés de Peter Fonda.
En 1999, elle est l'une des actrices principales de Roswell, diffusée sur la WB, dans laquelle elle incarne une extra-terrestre. La série lui offre une plus grande visibilité et lui permet de jouer dans deux films destinés au public adolescent : 100 Girls en 2000, puis Mortelle Saint-Valentin (avec David Boreanaz et Denise Richards) en 2001.
À la fin de la série, au terme de trois saisons, en 2002, Katherine Heigl poursuit sa carrière à la télévision, dans divers téléfilms. Parmi ceux-ci, elle tourne avec Kerr Smith dans Ultime menace (Critical assembly), l'histoire de deux étudiants qui fabriquent une arme nucléaire, un projet retardé suite aux attentats du 11 septembre 2001, ou une adaptation des Hauts de Hurlevent avec Mike Vogel. En 2005, elle reprend le rôle de Mira Sorvino dans Romy and Michele: In the Beginning (le prequel télévisé de Romy et Michelle, 10 ans après) et tient le rôle principal d'un film indépendant Side effects avant de voir sa carrière redémarrer vraiment avec la série Grey's Anatomy diffusée sur ABC à partir de mars 2005 et dont le succès est immédiat.
Dans cette série, elle interprète le rôle d'Isobel « Izzie » Stevens, qui lui vaut deux nominations aux Golden Globe dans la catégorie du meilleur second rôle féminin dans une production télévisée en 2007 et 2008 (prix qui revient finalement à Emily Blunt et Samantha Morton) avant de remporter un Emmy Award catégorie meilleur second rôle féminin dans une série dramatique, en septembre 2007. Peu après le début des tournages de Grey's Anatomy, Katherine Heigl décide de s'investir publiquement pour le don d'organes, auprès de l'association Donate Life America. Elle est d'autant plus concernée qu'après l'accident de voiture qui avait causé la mort de son frère Jason, alors qu'il avait quinze ans, en 1986, la famille Heigl avait choisi de léguer ses organes.
Parallèlement au tournage de la série, elle renoue avec le cinéma, dans des films mineurs, comme The Ringer, avec Johnny Knoxville (en 2005), ou Zyzzyx Road, considéré comme l'un des films les moins rentables du cinéma américain (en 2006), avant d'obtenir un succès au box-office, dans En cloque, mode d'emploi, en 2007 et dans
27 robes. Elle est également régulièrement présente depuis 2005 dans le classement des femmes les plus sexy du monde dans le magazine FHM.
En 2005, elle tourne dans le clip Only You du chanteur Josh Kelley qui deviendra son mari le 22 décembre 2007.
En mars 2010, elle décide de quitter la série Grey's Anatomy. Elle explique au magazine américain Entertainement Weekly que les raisons de son départ ne sont pas d'ordre professionnel mais d'ordre personnel car depuis qu'elle a adopté avec son mari une petite fille, elle souhaite se consacrer à sa famille, bien qu'elle ait de nombreux projets de films...
En 2010, elle interprète le rôle de Jennifer Kornfeldt dans Kiss&Kill où elle joue au côté de Ashton Kutcher. Par la suite un autre film Life as We Know It dans le rôle de Holly Berenson où elle joue au côté de Josh Duhamel. Le film est sorti le 8 octobre aux USA