Fils d'un compositeur iranien, André Hossein, et d'une comédienne native de Kiev (Ukraine), Robert Hossein suit très tôt des cours de théâtre, auprès notamment de René Simon et de Tania Balachova. Il obtient son premier succès d'estime à 19 ans, avec un rôle dans la pièce Les voyous. Il se dirige un temps vers la mise en scène, avec notamment Docteur Jekyll et Mister Hyde, La Chair de l'orchidée d'après James Hadley Chase, ou bien encore L'Homme traqué, d'après Francis Carco. Il débute sa carrière cinématographique en 1948 dans
Le Diable boiteux, de Sacha Guitry, où il tient un petit rôle de figuration. Sa carrière s'accélère avec le film de Jules Dassin, Du rififi chez les hommes. Il donne la réplique à Brigitte Bardot, dans Le Repos du guerrier, et à Sophia Loren, dans Madame sans gêne.
En 1955, il réalise son premier film, Les Salauds vont en enfer, tiré du livre de son ami Frédéric Dard, film dont il est également metteur en scène et acteur. Après Pardonnez nos offenses, qu'il réalise en 1956, et Toi le venin, le voilà en 1964, en héros romantique, incarnant Jeoffrey de Peyrac, dans Angélique Marquise des Anges, et dans un registre plus intimiste, La musica, de Marguerite Duras, en 1967. En 1968, il retrouve Michèle Mercier, sa partenaire d'Angélique, pour Une corde, un colt, western français qu'il réalise et interprète. De sa filmographie, on retiendra surtout - c'est l'avis de Robert Hossein - "Le Vampire de Düsseldorf", film sobre et prégnant, qu'il réalise et interprète avec Marie-France Pisier.
Il prend en charge en 1970 le théâtre populaire de Reims, expérimentant un théâtre traité comme un véritable spectacle cinématographique. À son retour à Paris, Il se lance dans une série de grands spectacles au Palais des Sports et du Palais des congrès de Paris, où le public est invité à prendre parti : Le Cuirassé Potemkine, Notre-Dame de Paris, ou bien encore Danton et Robespierre. La comédie musicale Les Misérables connaît un grand succès, et est reprise à Broadway.
Il a multiplié entre temps les apparitions au cinéma, notamment dans Le Casse, d'Henri Verneuil. En 1973 il jouait un prêtre et amant de Claude Jade dans l'émouvant Prêtres interdits de Denys de La Patellière. Dans Vénus beauté (institut), de Tonie Marshall, en 1999, il était un ancien aviateur.
Il s'est marié avec Marina Vlady le 23 décembre 1955 dont il a deux fils, Pierre et Igor, puis divorce. il épouse ensuite le 7 juin 1962 Caroline Eliacheff alors âgée de 15 ans, fille de Françoise Giroud, dont il a un fils. Il divorce de nouveau et se marie avec Candice Patou le 28 juin 1976. De 1973 à 1974 la jeune comédienne Michèle Watrin (elle incarnait la cousine de Claude Jade dans Prêtres interdits) était sa fiancée. Elle meurt en 1974 d'un accident de voiture.
Son fils, le rabbin Aaron Eliacheff donne des cours de religion à Strasbourg.
En 1979, il participe à l'ouvrage "Dieu existe ? oui" (Christian_Chabanis).
De 2000 à 2008, il dirige le théâtre Marigny.
En 2007, il présente une pièce intitulée N'ayez pas peur sur la vie de Jean-Paul II. À l'âge de quarante ans, il s'est fait baptiser dans la religion catholique. Il voue une dévotion toute particulière à sainte Thérèse de Lisieux.
En 2009, on a pu le voir aux côtés de Jean-Paul Belmondo dans le film
Un homme et son chien réalisé par Francis Huster.