Son bac en poche en 1996, Sophie Guillemin exerce plusieurs petits boulots, notamment figurante à Euro Disney et serveuse dans la restauration rapide. En 1998, remarquée par
Cédric Kahn, elle décroche le rôle principal de L'Ennui qui lui vaudra une nomination aux Césars dans la catégorie meilleur espoir féminin.
« Je n'ai rien préparé. C'était le désir de Cédric. Il voulait que je sois neutre et atone. Et quand j'en faisais trop, il me répétait : "Pense que tu es une secrétaire" », confiait-elle en février 1999 au Nouveau Cinéma.
Elle est souvent remarquée pour ses formes généreuses, inhabituelles chez les comédiennes.
En 2000, elle est à l'affiche de On fait comme on a dit puis de
Harry, un ami qui vous veut du bien. Elle y incarne la petite amie de Sergi López, rôle pour lequel elle sera à nouveau nommée pour le César du meilleur espoir féminin.
Elle enchaîne avec des comédies : Ça ira mieux demain et Du côté des filles. Dans A la folie, pas du tout, elle interprète la meilleure amie d'
Audrey Tautou.