Sylvie Testud naît le 17 janvier 1971 à Lyon dans une famille modeste d'origine italienne d'une mère comptable et d'un père qui les abandonne lorsqu'elle a deux ans. Elle passe son enfance et adolescence dans le quartier populaire lyonnais de la Croix-Rousse
En 1985, alors âgée de 14 ans, elle a une révélation pour le métier d'actrice en voyant Charlotte Gainsbourg dans son rôle de jeune fille complexée à laquelle elle s'identifie, dans le film L'Effrontée de Claude Miller. Elle prend alors des cours de théâtre à Lyon avec le comédien et metteur en scène Christian Taponard. En 1989, elle s'installe à Paris pour suivre des études d'histoire, ainsi que des cours d'art dramatique aux cours libres du Cours Florent, puis au Conservatoire national supérieur d'art dramatique pendant 3 ans, avec Jacques Lassalle et Catherine Hiegel pour professeurs.
Au début des années 1990, elle obtient ses premiers petits rôles au cinéma, puis des longs métrages comme L'Histoire du garçon qui voulait qu'on l'embrasse de Philippe Harel (1994), Le Plus bel âge..., de Didier Haudepin (1995) ou encore Love, etc. de Marion Vernoux (1996).
En 1997, Sylvie Testud connaît un premier grand succès au cinéma en Allemagne avec le film Au-delà du silence de Caroline Link, pour lequel elle apprend la langue allemande, la clarinette et la langue des signes. Elle est récompensée comme meilleure actrice aux Prix du Film allemand (l'équivalent allemand du César de la meilleure actrice). En 1998, elle joue son premier grand rôle au cinéma français et connaît son premier grand succès en France avec le rôle de Béa dans Karnaval, le premier long-métrage de Thomas Vincent, pour lequel elle est nommée au César du meilleur espoir féminin et reçoit le Prix Michel Simon. Elle commence alors une importante carrière d'actrice avec une préférence pour le cinéma d'auteur.
En 2000, sa prestation dans La Captive de Chantal Akerman (adaptation du roman La Prisonnière de Marcel Proust) lui vaut une nomination au prix de la meilleure actrice du Prix du cinéma européen. En 2001, elle obtient, pour sa deuxième nomination, le César du meilleur espoir féminin pour une interprétation biographique remarquée de Christine Papin, une des soeurs Papin, dans Les Blessures assassines de Jean-Pierre Denis, une histoire d'une jeune domestique qui souffre de psychose paranoïaque et qui avait défrayé la chronique en 1933 dans une affaire de meurtre de son employeuse avec la complicité de sa soeur Léa.
En 2003, Testud inaugure une carrière parallèle de romancière en publiant une biographie de sa vie d'actrice sous le titre Il n'y a pas beaucoup d'étoiles ce soir, aux éditions Pauvert.
En 2004, elle obtient un second César, cette fois celui de la meilleure actrice, ainsi que le Prix Lumière de la meilleure actrice et l'Étoile d'or du cinéma français pour le meilleur premier rôle féminin grâce à sa performance dans le film
Stupeur et tremblements d'Alain Corneau, une adaptation du roman biographique éponyme de la romancière à succès Amélie Nothomb, où elle joue le rôle de cette dernière en proie aux difficultés et à la différence de culture entre le monde professionnel japonais et le monde occidental belge dont elle est originaire. Pour ce rôle, elle a dû apprendre ses répliques en japonais grâce à une méthode phonétique.
Elle a deux enfants : Ruben (né le15 février 2005) et Esther (née le 25 janvier 2011.)