Timothy Dalton a des origines anglaises, italiennes et irlandaises. Sa mère est originaire du Bronx. Il grandit à Manchester, dans le milieu du spectacle. Après avoir quitté ses études, il se joint au National Youth Theatre (théâtre national de la jeunesse), pendant trois étés, et étudie à l'Académie Royale d'Art dramatique pendant deux ans. Il fait ensuite partie de la troupe du théâtre de Birmingham en 1966, où il joue un grand nombre de premiers rôles.
Son premier rôle au cinéma remonte à 1968, dans le film The lion in the winter Timothy Dalton incarne le roi de France et partage l'affiche avec Peter O'Toole, Katharine Hepburn et Anthony Hopkins. C'était avant tout un grand acteur shakespearien, naviguant entre le théâtre, le cinéma et la télévision.
Pierce Brosnan devait succéder à Roger Moore dans le rôle de James Bond, mais l'acteur était sous contrat avec la télévision pour la série Remington Steele. Timothy Dalton obtint finalement le rôle en août 1986 et interpréta l'agent 007 en 1987 dans Tuer n'est pas jouer (The Living Daylights) et 1989 dans Permis de tuer (Licence to Kill). Sa contribution permit de rendre Bond plus réaliste et beaucoup plus proche du héros de l'auteur Ian Fleming.
En raison de litiges entre Eon et la MGM, la production du dix-septième film de la série (Goldeneye) James Bond fut repoussée de six ans. Pendant ce temps de nombreuses rumeurs ont circulé sur le remplacement de Timothy Dalton. En avril 1994 il refusa officiellement le rôle, qui revint alors à Brosnan. Dalton a repris depuis sa carrière d'acteur au théâtre, bien qu'il continue d'apparaître au cinéma. En 2003, il tient de nouveau le rôle d'un agent secret dans Les Looney Tunes passent à l'action. Il revient à nouveau en 2009 dans l'épisode spécial de Noël de Doctor Who : The end of time dans le rôle du président des seigneurs du temps. Mais aussi en 2010 dans la saison 4 de Chuck à partir de l'épisode 7 : "Chuck vs. the First Fight" dans le rôle de Gregory Tuttle (spoiler: Alexei Volkoff), un agent du MI-6 responsable de Mary Bartowski (
Linda Hamilton), mère de chuck.