En 1988, elle obtient une licence de théâtre. Elle fait sa première apparition à la télévision dans The Guiding Light.
Au début de sa carrière, Calista enchaîne les rôles dans les festivals et les pièces en marge de Broadway sans réussir toutefois à percer. De 1989 à 1997, pour pouvoir se payer les services d'un agent artistique, la jeune comédienne, qui habite dans un petit appartement avec trois autres jeunes actrices, travaille comme serveuse puis comme professeur d'aérobic.
Après des prestations remarquées et récompensées dans les pièces Beside Herself et Les 3 soeurs, elle joue en 1994 à Broadway dans La Ménagerie de verre de
Tennessee Williams. La critique théâtrale est unanimement positive, et Calista Flockhart remporte un Theater World Award et un Clarence Derwent Award, deux prestigieux prix.
En 1991, elle obtient son premier rôle au cinéma dans Naked in New York de Daniel Algrant.
De 1997 à 2002, elle joue le rôle titre dans la série Ally McBeal.
Depuis 2006, elle joue dans la série Brothers & Sisters au côté de Sally Field