Charlize Theron naît à Benoni, une cité minière du Transvaal située à 25 kilomètres de Johannesburg le 7 août 1975, d'un père (Charles) d'ascendance française, et de mère (Gerda) d'origine allemande. Sa langue maternelle est l'afrikaans, l'anglais étant sa seconde langue. Charlize grandit en milieu rural dans la ferme de ses parents, par ailleurs propriétaires d'une entreprise de construction routière, et apprend le xhosa au contact des travailleurs de l'entreprise familiale.
À l'âge de 12 ans, Charlize est envoyée à la National School Of The Arts de Johannesburg. Elle y entretient sa passion pour la danse, dont elle débute la pratique dès ses 6 ans avec des cours de ballet. Ses performances font le ravissement de sa mère, qui l'encourage à développer ses talents artistiques. Ces expériences positives rendent les retours au domicile plus difficiles, tant sa situation familiale se dégrade. Son père Charles sombre peu à peu dans l'alcoolisme, et se montre de plus en plus distant vis à vis de sa famille. Puis, un jour de 1991, alors que Charlize est de retour de l'école pour le week-end, sa mère Gerda subit à nouveau les violences de son mari, et le tue par balles en état de légitime défense. Aucune poursuite judiciaire n'est engagée.
Sa mère a une influence positive dans sa vie, l'inscrit ensuite à un concours de mannequinat. Charlize, alors âgée de 16 ans, remporte ce concours et s'envole vers l'Italie pour représenter son pays au International New Model Today. Elle l'emporte encore une fois, ce qui lui offre l'opportunité de devenir mannequin professionnel. Elle quitte alors l'école et s'envole vers Milan, accompagnée de sa mère, pour débuter sa carrière de mannequin. Trois mois plus tard, sa mère Gerda retourne en Afrique du Sud à ses activités, tandis que Charlize s'installe à Milan et voyage à travers l'Europe pour son travail.
Après un an de travail en tant que mannequin, Charlize décide de s'adonner à sa passion pour le ballet et s'inscrit à la Joffrey Ballet School de New York, tout en acceptant quelques séances photos pour financer son séjour. Après 8 mois de cours, une blessure au genou la contraint à tirer un trait sur sa carrière de danseuse. Elle déménage alors vers Miami pour quelques mois et poursuit le mannequinat. Mais Charlize n'est pas intéressée par la vie de top model : elle veut avant tout développer ses talents artistiques.
En 1994, encore une fois encouragée par sa mère, Charlize s'envole pour Los Angeles dans l'espoir de démarrer une carrière d'actrice. Les débuts sont difficiles, et aucun agent ne semble intéressé par ses talents. La nervosité liée à sa condition fait ressurgir des ulcères dont elle souffrait déjà au début de son adolescence, dégradant ainsi sa santé pendant plusieurs mois. Un jour, alors que Charlize se présente à la banque pour encaisser un cheque de 500$ que sa mère lui a envoyé, le caissier lui en refuse l'encaissement. Charlize perd ses nerfs et insulte le guichetier et les clients de la banque. Theron est ensuite approchée par un homme témoin de son énervement et visiblement impressionné par sa « performance » dans la banque. Il annonce à Charlize qu'il pourrait l'aider dans sa carrière d'actrice. Cet homme n'est autre que John Crosby, découvreur de talents et agent d'acteurs tels que Rene Russo et John Hurt. Celui-ci envoie l'ambitieuse Theron à des cours de comédie, principalement pour effacer son accent Afrikaans très prononcé, et la fait profiter de ses connaissances.
En 1995, quelques mois après avoir débuté les cours de théâtre, Charlize fait ses débuts à l'écran dans Children Of the Corn III. Elle n'a pas de ligne de dialogue et n'apparaît que quelques secondes dans le film, mais d'autres opportunités se présentent. Elle accepte un rôle dans un pilote pour une série, Hollywood Confidential, avec Edward James Olmos, mais le pilote ne sera pas retenu et fait l'objet d'un téléfilm sorti plus tard en 1997.
Entre temps, Charlize Theron se crée une réputation de star montante à Hollywood, à travers ses participations dans des publicités pour Axe et Martini. Charlize Theron fait ses vrais débuts au cinéma dans Two Days In The Valley de John Herzfeld, un thriller dans lequel Theron tient le rôle de la fiancée de James Spader. Elle enchaine avec un petit rôle dans la comédie That Thing You Do!. Son jeu d'actrice est remarqué, à la fois par les critiques et par les acteurs tel Tom Hanks, qui sont impressionnés par son talent. Theron joue ensuite dans une nouvelle comédie, Le Plus fou des deux de Jonathan Lynn qui n'aura pas le succès commercial escompté.
Dans le film L'Associé du diable, Charlize Theron partage l'affiche avec Al Pacino et Keanu Reeves. Ce rôle d'une épouse schizophrénique est plus complexe, et illustre la progression de sa carrière vers des rôles plus intéressants. Le film constitue par ailleurs son premier succès commercial, et lui permet de confirmer son rang de star montante du cinéma. Les années suivantes, Theron enchaîne les tournages, avec les films tels que Celebrity, Intrusion ou Mon ami Joe.
Malgré la réussite professionnelle, les difficultés personnelles restent présentes. Dans son pays natal, sa mère Gerda se remarie, ce qui perturbe la relation fusionnelle mère-fille sur laquelle Charlize s'était beaucoup appuyée jusque là. Malgré tout, Charlize s'habitue à sa nouvelle situation familiale, jusqu'à ce que son demi-frère se tue dans un accident de voiture, le premier jour du tournage de Mon ami Joe. Cet accident aura raison de l'unité retrouvée dans la famille Theron, sa mère Gerda divorçant quelques mois plus tard. Celle-ci s'installe à Los Angeles pour se rapprocher de sa fille.
La carrière de Charlize Theron prend un tournant en 1999 avec le film Piège fatal, qui marque son détachement des simples seconds rôles d'épouse ou de petite amie. Ses personnages, à l'image de son rôle dans Piège fatal ou The Yards, lui permettent d'exprimer une palette d'émotions plus étendue, et par la même occasion d'élargir ses choix de rôles futurs. Les Chemins de la dignité est le quatrième film dans lequel elle participe dans la seule année 2000, témoignant des nombreuses sollicitations dont elle fait preuve.
Malgré ce début de carrière prometteur, les années 2000 voient se succéder des films au succès commercial très limité comme Le Sortilège du scorpion de jade, Mauvais piège ou encore Escapade à Reno. Le film symbole de cette courte période est
Sweet November en 2001, dans lequel Theron retrouve Keanu Reeves. Les critiques pour ce film sont désastreuses, et son rôle lui vaut une nomination aux Razzie Awards dans la catégorie « plus mauvaise actrice ».
L'année 2003 reste à ce jour comme la plus importante pour Charlize Theron, puisqu'elle tourne dans Braquage à l'italienne, son plus gros succès commercial à ce jour, et
Monster, qui lui vaudra l'Oscar de la meilleure actrice. En effet, pour habiter le rôle de Aileen Wuornos, Theron étudie un documentaire de Nick Broomfield de 1992 sur cette tueuse en série, et passe du temps avec une des amies de Wuornos, qui a entretenu une correspondance avec celle-ci lors de son séjour en prison. Pour le tournage Theron prend 15 kilos, et se fait remodeler le visage au silicone. A son actif également, le Golden Globe de la meilleure actrice, le Screen Actors Guild Award de la meilleure actrice et l'Ours d'argent de la meilleure interprétation féminine au Festival de Berlin.
À la suite de la cérémonie des Oscars, Charlize Theron fait un retour triomphant en Afrique du Sud où elle est accueillie comme une héroïne nationale, d'autant plus qu'aucune actrice africaine n'avait été distinguée depuis la création des Oscars. L'effet de l'obtention de cet Oscar fut si retentissant, que Charlize Theron fut reçue par l'ancien président sud africain Nelson Mandela et son successeur, le président Thabo Mbeki, qui lui offrit une once d'or. En outre, de nombreux parents en Afrique du Sud ont prénommé leurs filles Charlize suite à cet événement.
Depuis son rôle dans
Monster, Charlize Theron s'essaie à des rôles aussi différents que possible dans des drames (Nous étions libres, L'Affaire Josey Aimes) et des métrages de science-fiction (Æon Flux), démontrant ainsi sa légitimité en tant qu'actrice. Ce besoin de justification a toujours été une source de motivation; selon elle : « Il semble que toute ma carrière ait consisté à montrer la preuve que je pouvais tenir les rôles ».
En 2006, elle est nominée, une nouvelle fois, mais ne reçoit pas à cette occasion, un nouvel Oscar.
En 2007, Charlize Theron apparaît dans Dans la vallée d'Elah aux côtés de Tommy Lee Jones, et tourne Bataille à Seattle, un film écrit et réalisé par son compagnon Stuart Townsend.
En 2008, Charlize Theron devient officiellement citoyenne américaine.
Le 18 novembre 2008 elle est nommée Messagère de la paix des Nations unies pour son action envers les enfants pauvres d'Afrique du Sud.
Le 4 décembre 2009, elle est la présentatrice du tirage au sort de la coupe du monde de football 2010 au Cap (Afrique du Sud), événement diffusé dans 200 pays et suivi par plus de 200 millions de téléspectateurs. Au cours de la répetition générale, elle tire du chapeau la France en disant « Ireland » ce qui a causé la stupeur des organisateurs de la manifestation.
Elle apparaît dans la pub J'adore de Christian Dior. Elle est également présente dans le clip de « Crossfire », le premier single solo de Brandon Flowers.