Ancien élève du Lycée Chaptal, Jean-Louis Barrault est d'abord élève de Charles Dullin et acteur de sa troupe de 1933 à 1935. À 25 ans, sa rencontre avec Étienne Decroux le pousse à se passionner pour le mime.
Il entre à la Comédie-Française en 1940 et en devient le 408esociétaire le 1er janvier 1943. Il y met en scène Le Soulier de satin et Phèdre, deux pièces qui assureront sa célébrité. Il démissionnera le 31 août 1946.
Il est aussi acteur de cinéma, notamment en 1944 dans Les Enfants du paradis, grand succès de Marcel Carné, qui popularise son génie du mime.
En 1946 il fonde avec sa femme Madeleine Renaud la Compagnie Renaud-Barrault et s'installe pour dix ans au Théâtre Marigny. Ils engagent André Brunot, Pierre Bertin, Catherine Fonteney, Georges Le Roy, Jean Desailly, Jacques Dacqmine qui viennent de la Comédie-Française, Marie-Hélène Dasté, Régis Outin, Pierre Renoir, Simone Valère,
Jacqueline Bouvier, Gabriel Cattand, Jean-Pierre Granval, les musiciens Pierre Boulez et Maurice Jarre. En 1954, il emménage dans le théâtre le Petit Marigny.
Avec André Frank, il crée en 1953 la revue les Cahiers Renaud Barrault, publiés aux Éditions Julliard, puis chez Gallimard.
En 1958, il fonde le « Nouveau Cartel » avec André Barsacq, Jean Mercure et Raymond Rouleau.
À partir de 1959, André Malraux lui confie le Théâtre de l'Odéon qui devient L'Odéon-Théâtre de France, dont il devient le directeur. Barrault y manifeste un éclectisme qui pourra lui être reproché : il monte les grandes oeuvres du répertoire classique (Racine, Shakespeare), mais crée aussi les pièces les plus modernes : Rhinocéros de Eugène Ionesco en 1960, Oh les beaux jours de Samuel Beckett en 1963 (mise en scène par Roger Blin - le rôle de Winnie restera comme l'un des plus célèbres de Madeleine Renaud), Des journées entières dans les arbres de Marguerite Duras en 1965, Les Paravents de Jean Genet en 1966 (pièce qui, peu après la guerre d'Algérie, fait scandale). Il continue aussi à populariser le théâtre de Paul Claudel.
En mai 1968, Jean-Louis Barrault ouvre le théâtre de l'Odéon aux étudiants, qui l'occuperont pendant plus d'un mois. Malraux ne le lui pardonnera pas, il devra quitter le théâtre avec sa compagnie. Mais elle donne encore d'étonnants témoignages de sa vitalité : elle investit une salle de catch, l'Élysée Montmartre, puis va planter ses tréteaux en transformant la Gare d'Orsay en théâtre d'Orsay (l'actuel musée d'Orsay) puis au Théâtre du Rond-Point. Barrault y signe des créations originales à partir de sa lecture des grands auteurs (Rabelais, Ainsi parlait Zarathoustra, Zadig).