Pistilli est né à Grosseto en 1929. Il a suivi des études pour devenir comédien à Milan, au Piccolo Teatro de Giorgio Strehler. Il a obtenu son diplôme en 1955. Pistilli n'a jamais vraiment quitté le monde du théâtre et a souvent participé aux pièces dirigées par Giorgio Strehler. En 1947, il fait sa première apparition au cinéma dans Dark Passage.
Durant les années 1960, il devient connu grâce aux westerns de Sergio Leone. Il interprète le rôle de « Groggy » (bras droit de « L'Indien ») dans «
Et pour quelques dollars de plus » (1965). Dans «
Le Bon, la Brute et le Truand » (1966), il joue le rôle d'un prêtre, le frère de « Tuco ». Par la suite, Pistilli a eu un rôle régulier dans la série italienne « La Piovra » basée sur le thème de la mafia.
Il s'est suicidé en 1996 dans son domicile milanais peu avant d'apparaître dans la dernière représentation de « Tosca » (mise en scène par
Terence Rattigan). Tosca avait été fortement critiquée et Pistilli en avait été affecté. D'après sa dernière lettre, il avait sombré dans la dépression, état qui avait été renforcé par les commentaires négatifs du public au sujet de sa rupture avec l'actrice Milva.