Wentworth Earl Miller III est né le 2 juin 1972 en Angleterre, car son père y faisait ses études de droit, mais c'est aux États-Unis qu'il grandit, plus exactement dans le quartier new-yorkais de Brooklyn, où son père est assistant du procureur et sa mère enseignante spécialisée. Ensuite, sa famille s'installe à Sewickley en Pennsylvanie.
Son prénom provient de Captain Frederick Wentworth, un personnage du roman Persuasion de Jane Austen. Son père et son grand-père paternel se prénomment également Wentworth.
Wentworth Miller a de multiples origines : « Ma mère blanche est à la fois d'origine russe et libanaise. L'une de mes tantes m'a raconté que nous serions reliés à un pirate français, le capitaine Coquet... Mon père est noir, il a du sang Anglais, des origines syriennes et libanaises. Il a aussi une arrière grand-mère malienne-réunionnaise ». C'est l'une des raisons pour lesquelles il a étudié le français à l'université. Dans une autre interview, Wentworth précise également : « My father is black and my mother is white. Therefore, I could answer to either which kind of makes me a racial Lone Ranger, at times, caught between two communities. » (« Mon père est noir et ma mère est blanche. Ça fait de moi une sorte de cavalier solitaire des races, coincé entre deux cultures. »). Il a deux soeurs plus jeunes, Gillian et Leigh qui est la benjamine. Gillian fait des études de psychologie et Leigh est en école de droit.
Wentworth est diplômé en littérature de l'université de Princeton. Il est également passionné de musique et pendant ses années universitaires, il voyage à travers le monde pour chanter a cappella avec un groupe « The Princeton Tigertones ». Il part ensuite à Los Angeles, en 1995, pour devenir acteur. Il fait différents petits boulots derrière la caméra pour découvrir le milieu du cinéma avant de se présenter à des castings. Wentworth Miller explique : « Je suis donc parti travailler à Los Angeles pour une compagnie qui développait des téléfilms. En fait, mon travail consistait principalement à faire des photocopies et aller chercher des sandwiches pour mon patron ». Il travaillait également dans « des agences, des sociétés de management, des chaînes de télé, des compagnies de production ».
En 1998, il fait ses débuts devant la caméra dans Les Hommes-Poissons, un épisode de la deuxième saison de Buffy contre les vampires. Après de nouvelles apparitions dans Popular, Le Monde de Joan et Urgences (2000), Wentworth connaît son premier grand rôle dans la mini-série fantastique Dinotopia (2002). Il tourne également dans le film La Couleur du mensonge (The Human Stain), adapté du roman La Tache de Philip Roth, où il joue le personnage d'Anthony Hopkins jeune. Il campe le rôle d'un métis à l'apparence de blanc, qui ment sur ses origines pour réussir socialement, histoire qui se rapproche de sa propre vie. Puis dans
Underworld avec Kate Beckinsale. La consécration arrive avec le rôle de Michael Scofield dans la série Prison Break. On a également pu l'apercevoir dans deux clips vidéos de Mariah Carey It's Like That et We Belong Together. Ceux-ci ont été réalisés par Brett Ratner qui a réalisé le pilote de Prison Break. Par ailleurs, Wentworth vient d'achever son premier script qu'il décrit comme « Une histoire d'amour avec un soupçon d'
Hitchcock. Un croisement entre Le Beau-père, L'Ombre d'un doute et la mythologie de Dracula ». Il a aussi joué un petit rôle dans la série Ghost Whisperer (le rôle d'un soldat mort pendant la guerre du Vietnam en 1972). Cet épisode était le premier de la saison 1 qui a été tourné en 2005 et 2006.
En 2005 sa carrière prend un nouveau tournant puisqu'il obtient le rôle de Michael Scofield dans la série à succès Prison Break. Il incarne un jeune ingénieur qui se fait emprisonner délibérément afin de sauver son frère condamné à mort pour un meurtre qu'il n'a pas commis, il incarnera ce rôle pendant quatre ans. Grâce à la série Prison Break, il devient rapidement l'une des stars les plus convoitées d'Hollywood et dans le monde, aussi bien pour ses talents d'acteur que pour sa plastique parfaite. Bien qu'il soit très apprécié du grand public, Wentworth préfère se consacrer uniquement à la série mais il participe à plusieurs campagnes de publicités tel que pour la célèbre marque de vêtement GAP et principalement en Asie pour Bean Pole Jeans, French Café (Corée), Me and City et Chevrolet (Chine).
Depuis l'arrêt de la série Prison Break Wentworth se fait rare à la télévision, mais il a tout de même participé au premier épisode de la saison 11 de la série New York Unité Spéciale. Il interprète Nate Kandal, un policier qui sauve une victime de viol et ne veut parler qu'à Benson et Stabler. L'épisode a été diffusée le mercredi 23 septembre 2009 à 21h00, sur la chaîne américaine NBC. Wentworth Miller a aussi prêté sa voix pour un dessin animé. Il a en effet été sollicité pour doubler les voix de deux personnages, Jock et Popular, du dessin animé Family Guy. L'épisode 13 de la saison 7, intitulé 'Stew-roids', a été diffusée le 26 avril 2009 sur la FOX.
Lors d'un voyage en Chine, Wentworth a parlé d'un film qu'il aurait tourné dans le salon du réalisateur. Il a avoué vouloir changer de registre après avoir interprété Michael Scofield pendant aussi longtemps. Il s'agit d'un petit film indépendant qui parle de la relation entre un homme et sa femme, un film sans prison, sans conspiration gouvernementale, sans cascades et qui sera selon lui un agréable changement par rapport à ce qu'il a fait jusqu'à maintenant.
Il a également décroché le rôle de Chris Redfield, personnage bien connue des gamers, dans le quatrième volets de la saga Resident Evil, intitulé Resident Evil: Afterlife. Wentworth devrait être un élément clé dans ce nouvel épisode... Il sera en tête d'affiche au côté de Milla Jovovich, Boris Kodjoe et Ali Larter, celle ci déja présente dans le troisième épisode avec le rôle de Claire Redfield, la soeur de Chris, elle aussi connue des gamers. Le film devrait sortir le 10 septembre 2010 aux Etats-Unis, pour une sortie française prévue le 22 septembre 2010.
En parallèle à sa carrière de comédien, Wentworth reprend l'uniforme de Michael Scofield pour les besoins du jeu video, ou il prête non seulement ses traits mais aussi sa voix, comme la plupart des protagonistes présent dans la série. Le jeu s'intitule Prison Break : The Conspiracy et se déroule dans l'univers de la première saison. il est disponible à la vente depuis le 25 mars 2010 sur PC, Playstation 3 et Xbox 360.
Son dernier projet en date serait le film The Mourning Portrait, dont l'histoire parle d'un photographe ambulant terrorisant un contrebandier en deuil et ses deux jeunes filles. Wentworth Miller a accepté le rôle du photographe dans cette effrayante histoire... Le début du tournage est prévu pour la fin 2010 et sera en salle en 2011.
Depuis l'arrêt de Prison Break, l'acteur reçois de nombreuse demande à la fois à la télévision et au cinéma, il devrait être très prochainement de retour à la télévision dans la série télévisée "Identity" adaptation US d'une série anglaise. La série parle d'une unité du FBI chargée de combattre les crimes de vols d'identité. Un pilote de présentation a ainsi été commandé et les acteurs sont en cours de recrutement. Si Wentworth Miller accepte le rôle, il devrait y incarné le personnage de John Bloom un ancien agent sous couverture que l'on force à rejoindre l'équipe. Puis il retournera ensuite affronter de nouveaux monstres dans le cinquième volet de la franchise Resident Evil ou il reprendra sont rôle de Chris Redfield qu'il tenait déjà dans le quatrième opus Resident Evil: Afterlife.