William L. Petersen naît à Evanston, juste au nord de Chicago, d'un père d'origine danoise et d'une mère d'origine allemande. Après avoir été diplômé du Bishop Kelly High School à Boise (Idaho), Petersen étudie à l'université de l'Idaho, de laquelle il a obtenu une bourse pour appartenir à l'équipe de football. C'est là qu'il découvre le théâtre. Plus tard, après avoir déménagé à Chicago, il devint membre de la Steppenwolf Theatre Company. Il effectue, au début des années 1970, un séjour à Bilbao, dans le nord de l´Espagne pour suivre son professeur d'art dramatique et pour perfectionner ses talents de comédien. Il y découvre et apprend l´Espagnol. Il donnera à sa fille un prénom basque : Maité (« Aimée » en basque).
De retour aux États-Unis, il joue à plusieurs reprises sur scène de petites productions avant d'être remarqué par
Michael Mann qui le fait débuter au cinéma en 1981 dans son film Le Solitaire. Petersen tourne ensuite pour
William Friedkin dans Police fédérale Los Angeles (1985) aux côtés de
Willem Dafoe et apparaît dans un épisode de la Cinquième Dimension en 1986.
Toujours en 1986, il retrouve Michael Mann pour incarner le personnage de Will Graham dans Le Sixième Sens, inspiré du roman Dragon rouge (première apparition au cinéma du personnage d'Hannibal Lecter).
Dans les années 1990, Petersen joue dans plusieurs films, tels que
Young Guns 2 (1990), Hard Promises (1991), Passed Away (1992) ou
Fear (1996). Plus récemment, en 2000, il apparaît dans The Skulls : société secrète de Rob Cohen.
C'est le passage à la télévision qui va lui apporter une notoriété internationale. L'acteur joue d'abord en 1993 dans Return à Lonesome Dove, la suite d'une mini-série très bien accueillie à la fin des années 1980.
Et surtout, à partir de 2001, il incarne Gil Grissom, responsable de l'équipe de nuit de la police scientifique de Las Vegas dans Les Experts, la série télévisée la plus regardée au monde en 2007.
Il quitte la série lors de l'épisode 10 de la saison 9, remplacé par
Laurence Fishburne.
Dans l'émission Sacrée Soirée du 16 décembre 2009, il laisse supposer un retour dans la série et parle d'un film qui se déroulerait à Las Vegas et à Paris. Il aurait laissé entendre qu'un contact aurait été établit dans les coulisses avec
Jean Reno pour le rôle d'un inspecteur français. Il lui aurait demandé de contacter son agent. Carol Meldensohn, la productrice de la série, a depuis démenti cette rumeur.