Benicio del Toro est le second fils d'un couple d'avocats, il grandit à Santurce, un quartier de San Juan de Porto Rico. À la suite du décès de sa mère alors qu'il est âgé de 9 ans, la famille déménage à Mercersburg dans la campagne de Pennsylvanie. À l'âge de 13 ans, Benicio est inscrit dans une pension préparant aux meilleures écoles. Son père veut faire de lui un avocat. Il suit les conseils de son père et part étudier à l'université de Californie à San Diego, mais il abandonne rapidement pour entrer à la célèbre Square Acting School de New York.
Il débute avec de petits rôles dans plusieurs séries dont Deux flics à Miami en 1984 ou Ohara en 1987. Il obtiendra un peu plus tard ses premiers petits rôles au cinéma entre autres dans Permis de tuer en devenant le plus jeune adversaire de James Bond. On le retrouve ensuite dans des seconds rôles dans Etat second et surtout dans Usual Suspects de Bryan Singer.
Le succès planétaire de cette petite production marque un tournant dans sa carrière, en offrant à Benicio del Toro la reconnaissance au sein de la profession, lui permettant de choisir ses projets artistiques. On le retrouve ainsi à contre-emploi dans le très décalé Las Vegas Parano au côté de Johnny Depp.
2000 est une grande année pour lui où l'on le retrouve dans 3 grands films : Snatch : Tu braques ou tu raques de Guy Ritchie, Way of the Gun et surtout
Traffic où Benicio obtient son premier grand premier rôle et se fait connaitre du grand public. La consécration arrivera avec son interprétation de Che Guevara dans le diptyque Che.