Dorothy Sebastian débute au cinéma en 1925, participant à soixante-trois films américains (la moitié étant des muets) jusqu'en 1948. Un de ses films les plus connus est
Le Figurant (1929), aux côtés de
Buster Keaton. Au moment de son premier mariage en 1935, elle se retire quasiment, ne revenant au cinéma, à partir de 1937, que pour dix films (le plus souvent dans des petits rôles, parfois non-crédités), dont trois westerns avec
Roy Rogers en 1939. Après son second mariage en 1947, elle se retire définitivement.
Au théâtre, Dorothy Sebastian participe à une revue représentée à Broadway (New York) en 1924.
Elle meurt d'un cancer en 1957, peu avant ses 54 ans. Une étoile lui est dédiée sur le Walk of Fame d'Hollywood Boulevard.