John Belushi est l'un des fils d'une famille de quatre enfants, dont son frère
James, qui deviendra lui aussi comédien. Son père, Adam, était un immigrant venu d'Albanie en 1934 à l'âge de 15 ans et est restaurateur de son état. Le jeune adolescent est très populaire auprès de ses camarades du fait de sa triple activité : d'abord de joueur dans l'équipe de football américain de son école secondaire, ensuite comme batteur dans un groupe de rock'n'roll et enfin comme acteur aux dons comiques fort prometteurs. En 1967, John se produit dans une tournée estivale, puis va s'inscrire à l'Université du Wisconsin afin d'y obtenir un diplôme en Art Dramatique, mais est contraint d'abandonner ce projet du fait d'ennuis financiers familiaux. Il va alors suivre les cours du collège de DuPage où, avec deux autres étudiants, il forme un trio comique, The West Compass Players qui, au terme des études, en 1970, se rend à Chicago.
John Belushi est remarqué par un membre de la Second City, la plus célèbre troupe d'improvisateurs où, entre autres son futur acolyte Dan Aykroyd, Chevy Chase et Bill Murray ont fait leurs classes et va se produire pendant un an et demi jusqu'à ce que sa désopilante imitation de Joe Cocker le fasse engager dans la troupe de la revue off-Broadway du magazine National Lampoon : Lemmings. Acclamé par la critique, il participe quelque temps comme acteur, scénariste et réalisateur à l'émission radiophonique du magazine National Lampoon Radio Hour.
En 1975, sa carrière prend un tournant lorsqu'il rejoint l'équipe d'une nouvelle émission de télévision qui va devenir l'une des émissions humoristiques les plus connues : Saturday Night Live. Cumulant les fonctions d'acteur et de scénariste du show jusqu'en 1979, il obtient un Emmy Award en 1977.
En 1978, il débute au cinéma avec le film En route vers le Sud, réalisé par Jack Nicholson, où il est un shérif-adjoint mexicain. Mais c'est avec le rôle de Bluto, sorte de colosse imbécile, brutal et vulgaire, membre d'une fraternité ringarde dans Animal House, comédie loufoque de John Landis, que sa carrière cinématographique est lancée. En effet, le film obtient un véritable succès engrangeant 141 millions de dollars de recettes pour un budget estimé à 3 millions de dollars. Après une participation dans le film Old Boyfriends, suivi du doublage pour la version américaine de Tarzoon, la honte de la jungle, il tourne
1941, réalisé par Steven Spielberg, où il joue un pilote de chasse complètement dément, proche de Bluto. Mais le film, sorti en 1979, est un échec commercial.
En 1980, il reprend le personnage de "Joliet" Jake Blues - qu'il a créé dans l'émission Saturday Night Live pour le film The Blues Brothers, réalisé par Landis et dont il partage la vedette avec Dan Aykroyd. Le film va connaître un immense succès commercial.
Cependant, il ne veut pas rester enfermé dans des silhouettes burlesques et Belushi, grand admirateur de Marlon Brando, cherche à changer de registre et à interpréter des personnages plus riches, plus complexes, notamment en jouant un journaliste sympathique dans la comédie romantique Continental Divide et un bourgeois strict et « coincé » dans la comédie satirique dans Les Voisins, où il retrouve Aykroyd pour une troisième et ultime fois, puisqu'il s'agit du dernier film de John Belushi. Il est décédé à l'âge de 33 ans .