Fils de l'acteur et metteur en scène Georges Wilson. Parlant aussi bien français qu'anglais, Lambert Wilson baigne dès son plus jeune âge dans le milieu théâtral.
Il suit de 1974 à 1978 une formation d'art dramatique au Drama Centre de Londres, où il apprend le métier d'acteur mais aussi le chant et la musique.
Il débute en 1977 dans Julia, sous la direction de Fred Zinnemann qui lui offre un premier grand rôle cinq ans plus tard dans Cinq jours ce printemps-là, face à Sean Connery. Il commence sa carrière française en 1979 avec Le Gendarme et les Extra-terrestres, de Jean Girault, dans une scène restée culte face à Maurice Risch, puis en 1984 avec La Femme publique d'Andrzej ?u?awski et Rendez-vous d'André Téchiné. Il explose en 1987 avec le film Chouans ! et enchaîne l'année suivante avec Les Possédés. Mais deux longs métrages bien spécifiques lui permettent de s'imposer aux yeux des critiques et du grand public : La Vouivre (1988), adapté et réalisé par son père Georges Wilson et surtout Hiver 54, l'abbé Pierre (1989), où il prête ses traits à l'Abbé Pierre. Pour cette performance saluée par la profession, il reçoit le Prix Jean Gabin récompensant les espoirs du cinéma français.
Il ne cesse alors de se diversifier, du film à costumes (Jefferson à Paris, 1995) à la comédie musicale (On connaît la chanson, 1997) en passant par la comédie populaire (Jet Set, 2000), le film-choral (L'Anniversaire, 2005) ou la comédie décalée (Palais royal !, 2005). Il est également employé par le cinéma américain : il est le « Mérovingien » dans Matrix reloaded (2002) et Matrix revolution (id.), puis apparaît aux génériques de Prisonniers du temps (2002) et Catwoman (2003), réalisé par son compatriote Pitof. En 2006, il joue dans le film de science-fiction Dante 01 de Marc Caro.
Sa carrière théâtrale est aussi très riche. Ashes d'Harold Pinter en 1998, L'Amour de l'Amour, La Machine Infernale, La Célestine, Eurydice, Ruy Blas. Il s'est mis en scène dans Les Caprices de Marianne en 1994 et dans Bérénice, avec Kristin Scott Thomas, en 2002.
Il est aussi chanteur et a enregistré quelques disques (Musicals en 1989 et Démons et merveilles en 1997).
Il a tourné aussi pour la télévision, notamment dans le téléfilm de Nadine Trintignant, Colette, une femme libre.
Il a également participé à une campagne publicitaire à la radio en faveur de la Fondation Abbé-Pierre.
Depuis quelques années, le comédien enregistre également la lecture de poésies et de grands textes de la littérature (Musset, Proust, ...).
Lambert Wilson a été élevé au rang d'Officier des Arts et Lettres par le ministre de la Culture Renaud Donnedieu de Vabres le 7 février 2007.
Le 15 octobre 2007, il sort un nouvel album intitulé "Loin", dans un registre totalement différent de ses précédentes interprétations dont il a écrit un des textes. Le compositeur en est Jean-Philippe Bernaux mais l'album inclut aussi deux compositions de Jean-Jacques Sage également producteur de l'artiste et une de Christophe Mali (Tryo). Les auteurs qui ont travaillé sur ce projet sont Boris Bergman, Philippe Latger, Marc Esteve et Marie Nimier.
En 2009, il écrit la préface du livre de Loïc Le Goff sur le Mouvement Emmaüs Compagnons de l'abbé Pierre, publié aux éditions Bayard.
En 2010, il est sur la scène du Théâtre du Châtelet dans la comédie musicale de Stephen Sondheim A Little Night Music.
La même année sort le film
Des hommes et des dieux dont il est le personnage principal. On apprend la même année au hasard d'une interview que bien que prudent vis à vis des religions (« Les religions créent les guerres. La foi engendre de l'amour »), il s'est fait baptiser par l'Abbé Pierre pendant le tournage d'Hiver 54. Il s'en explique : « De lui, j'aime toutes les valeurs ».