Stephen Colbert est né à Washington, D.C. et a grandi à Charleston, Caroline du Sud sur James Island. Il est le benjamin d'une famille catholique d'origine irlandaise de 11 enfants. Son père, le docteur James Colbert, était vice-président chargé des affaires académiques de l'université de médecine de Caroline du Sud. Sa mère, Lorna Colbert, était femme au foyer. Dans les interviews, Colbert décrit ses parents comme dévots, accordant une très grande importance aux valeurs intellectuelles. Ils disaient à leurs enfants qu'il était possible de questionner les principes de l'Église et d'être tout de même catholique. Le zèle de la famille en faveur de l'intellectualisme conduira très vite le jeune Colbert à s'efforcer à perdre son accent du Sud. Enfant il observe que les gens du sud sont souvent décrits par la télévision comme des personnes moins intelligentes que les autres. Pour éviter d'être victime de ce stéréotype, il apprendra très tôt par lui-même à imiter le langage des animateurs de débats télévisés américains.
Stephen Colbert est de descendance irlandaise. Son nom de famille toutefois est d'origine germanique, Coldberht (cold = froid + berht = brillant), le patronyme peut aussi correspondre à l'ancien français collibert, collivert, colvert (= serf, puis homme de basse condition). C'est dans la Somme et la Marne qu'il est le plus fréquent. Au sein de sa famille son nom se prononce « Col-burt » , mais son père voulait qu'on le prononce « Col-bère », acceptant « col-burt » seulement par respect pour son propre père. A cause de cela, James Colbert donna la possibilité à ses enfants de choisir la prononciation qu'ils souhaitaient. Stephen Colbert utilisera la prononciation « Col-bare » plus tard lorsqu'il sera transféré à l'Université Northwestern, se donnant ainsi la possibilité de se réinventer dans un nouvel endroit où personne ne le connaissait. Le 11 septembre 1974, alors que Stephen n'avait que 10 ans, son père et deux de ses frères, Peter et Paul, furent tués dans le crash du vol 212 d'Eastern Air Lines lors de sa tentative d'atterrissage à Charlotte, Caroline du Nord. Ils étaient en route pour s'inscrire à la Canterbury School de New Milford, Connecticut. Par la suite, Lorna Colbert déménagea avec sa famille en centre ville, dans le cadre plus urbain de East Bay Street à Charleston. À l'en croire, Colbert trouva la transition difficile et ne se fit pas facilement d'amis dans son nouveau quartier. Il développa une passion pour les romans de science-fiction et de fantasy, spécialement pour le monde de J. R. R. Tolkien dont il reste un grand fan. Pendant son adolescence, il se découvrit un intérêt grandissant pour les jeux de rôles et notamment pour Donjons et dragons. Un passe-temps dont il dira plus tard qu'il fut une introduction à l'art de la comédie et de l'improvisation.
Colbert étudia à l'Episcopal Porter-Gaud School, où il participa à plusieurs pièces et apporta sa contribution au journal de l'école, mais, à l'en croire, il n'était pas hautement motivé. Quand il était plus jeune, il avait espéré étudier la biologie marine. Mais une intervention chirurgicale pour réparer une perforation sévère du tympan provoqua un dommage à l'oreille interne important qui non seulement l'écarta d'une carrière qui impliquait de la plongée sous-marine, mais surtout le rendit sourd de l'oreille droite. Pendant un moment, il fut incertain quant à son inscription à l'université. Il se décida au dernier moment et fut accepté au Hampden-Sydney College de Virginie où un de ses amis s'était inscrit. Là, il continua à participer à des pièces tout en étudiant principalement la philosophie. Il trouva le programme difficile, mais était plus concentré que pendant ces années de lycée et il fut capable de s'appliquer sérieusement à ces études. Malgré la pauvreté de la vie théâtrale de Hampden-Sydney, l'intérêt de Colbert pour la comédie ne cessa de s'accroître. Après deux années, il partit pour l'École de Communication de l'Université Northwestern pour étudier l'interprétation, encouragé par l'amour de la scène qui se manifestait même quand personne n'assistait aux spectacles.
À Northwestern, Colbert étudia avec l'intention de devenir acteur dramatique ; il jouait la plupart du temps des pièces expérimentales et n'était pas intéressé par la comédie. Il débuta dans l'improvisation à l'Annoyance de Chicago dans le cadre des épreuves d'improvisation de l' « improvOlympic » fondé par Del Close et Charna Halpern. À l'époque, le projet était plus basé sur la compétition et une forme d'improvisation longue que sur le type d'improvisation qu'on utilisait dans les comédies.
"Je n'allais pas faire Second City" rappela Colbert plus tard, repensant à cette époque, "Parce que ceux d'Annoyance méprisaient Second City, pour eux ce n'était pas de la pure impro - Il y avait cette qualité mystique et légèrement snob chez les membres d'Annoyance".
Colbert obtint son diplôme en 1986 et se trouva dans la nécessité de travailler. Un ami qui était employé au guichet du théâtre de Second City lui offrit la possibilité d'y travailler comme standardiste et vendeur à la boutique de souvenirs. Colbert accepta et découvrit que les employés du Second City étaient autorisés à assister aux cours gratuitement. Malgré sa réticence initiale pour la troupe, il s'inscrivit aux classes d'improvisation et apprécia grandement l'expérience.
Peu de temps après, il était engagé en temps qu'acteur par la troupe en tournée de Second City (au départ comme doublure de
Steve Carell). C'est à cette occasion qu'il rencontra
Amy Sedaris et Paul Dinello, acteurs avec lesquels, plus tard, il collaborera souvent au cours de sa carrière. De par leurs parcours respectifs, les trois comédiens ne s'entendaient pas bien ensemble - Dinello pensait que Colbert était coincé alors que Colbert pensait de Dinello qu'il était « un voyou analphabète ». Malgré tout, les trois comparses finirent par devenir très proches pendant la tournée, découvrant qu'ils partageaient le même sens de l'humour. Quand on offrit à
Sedaris et à Dinello l'opportunité de créer une série télévisée pour HBO Downtown Productions, Colbert quitta Second City et déménagea à New York de façon à pouvoir travailler avec eux sur les sketches humoristiques de leur show Exit 57. La série débuta en 1995 et fut diffusée jusqu'en 1996. Malgré seulement 12 épisodes, le show reçu des critiques favorables et fut nommé pour cinq CableACE Awards en 1995, dans les catégories de meilleur scénario, meilleure interprétation et meilleure série humoristique. À la suite de l'annulation d'Exit 57, Colbert travailla six mois comme acteur et scénariste du Dana Carvey Show dont la distribution comptait des personnalités comme, entre autres, son camarade de « Second City », Steve Carell, ainsi que
Robert Smigel,
Charlie Kaufman, Louis C.K. et Dino Stamatopoulos. La série, décrite par un critique comme une satire « kamikaze », « d'un goût douteux », a vu certains sponsors se retirer après la diffusion du premier épisode, et la série été annulée après sept épisodes. Colbert travailla alors un court moment comme pigiste pour Saturday Night Live avec
Robert Smigel qui avait apporté son cartoon The Ambiguously Gay Duo du Dana Carvey Show à Saturday Night Live. Colbert faisait la voix d' « Ace » et Carell celle de « Gary ». Ayant besoin d'argent, il travailla également comme « script consultant » pour VH1 et MTV.