Timothy Olyphant suit des cours d'art dramatique et de théâtre en Californie avant de faire ses débuts à New York, où il reçoit une récompense pour sa prestation dans la pièce « The Monogamist » (1995). Après une apparition dans le pilote de la série Mr. & Mrs. Smith (1996) et dans un épisode de Sex and the City (1998), il est choisi pour faire régner la loi à Deadwood (2004), où il incarne Seth Bullock.
Sur grand écran dès 1996 dans Le Club des ex aux côtés de Diane Keaton, Timothy Olyphant joue ensuite dans Scream 2 (1997) de Wes Craven. Revendeur de drogue dans
Go (1999), il devient détective dans 60 secondes chrono (2000), puis agent d'une actrice porno, Elisha Cuthbert, dans la comédie The Girl Next Door (2004).
Il joue ensuite aux côtés de Jennifer Garner dans Ma vie sans lui (2007) avant de participer à Stop-Loss (2007), un film parlant de la guerre en Irak. Son rôle de méchant dans Die Hard 4 (2007) le confronte à Bruce Willis et reste du côté des gangsters avec
Hitman (2007), où il endosse la panoplie du tueur à gages sanguinaire, dans l'adaptation du célèbre jeu vidéo produite par Luc Besson. Il aurait dû réenfiler son costume du shérif Seth Bullock pour les deux téléfilms de Deadwood (2006), qui clôtureraient la série, mais ceux-ci ne verront finalement pas le jour.
Il a également un frère qui est producteur.