Fils d'enseignant, Wolfgang Preiss étudie la philosophie, les lettres et le théâtre au début des années 30. Il prend également des cours privés avec Hans Schlenck et fait des apparitions dans diverses productions théâtres à Heidelberg, Kaliningrad, Bonn, Brême, Stuttgart et Berlin.
En 1941, il rejoint le théâtre populaire berlinois d'Eugen Klöpfer, son enrôlement dans l'unité de défense aérienne de la Wehrmacht en avril 1941 lui permet de poursuivre son activité théâtrale. Jusqu'alors, il a été "laissé de côté" parce qu'un officier du bureau de révision était un de ses admirateurs.
En 1942, il fait ses débuts au cinéma dans une production de l'UFA : Le Grand Amour, un film de propagande avec Zarah Leander. Après la guerre, Wolfgang Preiss retourne au théâtre, et à partir de 1949 il prête sa voix au doublage de films en allemand.
En 1954, il revient au cinéma en apparaissant dans L'Amiral Canaris d'Alfred Weidenmann. L'année suivante, il incarne le rôle principal de Claus von Stauffenberg dans le film de Falk Harnack, Le 20 juillet qui a trait au complot visant à assassiner Hitler en 1944. Il se voit décerné pour ce rôle le Prix Fédéral du Film en 1956 et jouit d'une certaine notoriété.
Dès lors, Wolfgang Preiss se cantonne aux rôles d'officier droit et loyal qu'il joua dans plusieurs films et dans de nombreuses productions internationales, principalement en Italie et aux États-Unis, jouant occasionnellement un plus typique officier nazi cynique ou brutal.
Il apparaît dans des productions telles que Le Jour le plus long (1962), Un pont trop loin de Richard Attenborough (1977), Le Cardinal d'Otto Preminger (1963), et avec Jean-Paul Belmondo dans Paris brûle-t-il ? (1966). Il est en tête d'affiche aux côtés de Burt Lancaster dans Le Train de John Frankenheimer (1964), de Frank Sinatra dans L'Express du colonel von Ryan (1965), de Robert Mitchum dans La Bataille pour Anzio (1968), et de
Richard Burton dans Le Cinquième commando (1971).
En outre, pour le public ouest-allemand, il devient l'incarnation du génie maléfique pour son rôle du Dr. Mabuse. Il joue ce rôle pour la première fois en 1960 (succédant à Rudolf Klein-Rogge) dans Le Diabolique Docteur Mabuse de Fritz Lang puis à quatre autres reprises.
Dès le milieu des années 60, Wolfgang Preiss tourne davantage pour la télévision, jouant notamment Georges-Marie Haardt dans La Cloche tibétaine et le général Walther von Brauchitsch dans les télésuites américaines Le Souffle de la guerre et War and Remembrance, basées sur les livres de Herman Wouk.
En 1987, il reçoit un second Prix Fédéral du Film pour l'ensemble de sa carrière, qui aura comporté plus de 100 participations dont près de 30 pour des rôles d'officier allemand. Il meurt à la suite d'une chute à l'âge de 92 ans.