Depuis l'adolescence, Pascal Duquenne, s'initie aux arts du spectacle, notamment au sein de la troupe du Créahm (création et handicap mental) à Bruxelles avec laquelle il participe à de nombreuses créations en danse et théâtre.
C'est au cours d'un de ces spectacles qu'il est remarqué par le réalisateur Jaco Van Dormael qui quelques années plus tard, lui offrira ses premiers rôles au cinéma.
En 1996, il obtient conjointement avec Daniel Auteuil, le Prix d'interprétation masculine du Festival de Cannes pour le film Le Huitième Jour dans lequel il joue le rôle d'un jeune homme qui a le syndrome de Down.
Cette distinction et le succès du film contribuent à la modification du regard porté par la société sur le monde du handicap et à une meilleure acceptation de la différence. En 2002 est créée en Belgique une association, dont fait partie Pascal Duquenne, nommée Le 8e jour, dont l'objectif est l'intégration des personnes handicapées par la création de maisons communautaires autonomes.
Après une tournée dans plusieurs pays d'Europe avec "Le Père Noël voit rouge", pièce écrite et interprétée par quatre comédiens trisomiques, il participe à un spectacle de danse, "Champ d'émotion" présenté jusqu'aux Antilles.
Depuis 2000, Pascal Duquenne participe à l'atelier gravure du Créahm de Bruxelles. Il utilise le monotype et crée des portraits ainsi que des bustes de femmes en noir et blanc. Ses oeuvres témoignent de moyens formels simples : fond sobre, traits du visage et du corps évoqués en quelques traits ou en quelques taches noires, pas de modelé. Cette épuration des formes donne une puissance d'expression à ces femmes qui envahissent l'espace de l'oeuvre.
En 2004, il devient Commandeur de l'Ordre de la Couronne par le roi Albert II de Belgique.
En 2009, il participe à une publicité pour l'opérateur virtuel Simyo. Le directeur marketing de l'opérateur explique: "En y réfléchissant, j'ai réalisé que cela rejoignait totalement nos valeurs. Nous revendiquons d'être un opérateur différent et nous avons choisi un comédien différent". Cela crée une polémique dans le milieu de la publicité française.
En 2010, il fait une brève apparition dans une scène du film
Mr Nobody du réalisateur Jaco Van Dormael.