Bien que né à New Liskeard, en Ontario d'un père franco-ontarien et d'une mère québécoise, il passe la plupart de sa jeunesse à Amos (Québec), en Abitibi-Témiscamingue. De onze ans à quatorze ans, il vit à Kapuskasing, en Ontario. Après le divorce des parents, avec sa mère, sa soeur, et son frère, la famille Dupuis déménage dans le quartier Sainte-Rose à Laval. Il étudie l'art dramatique à l'École nationale de théâtre du Canada, à Montréal, reçoit son diplôme en 1986. Pendant les années 1980, il se produit dans plusieurs productions théâtrales et il obtient quelques rôles à la télévision et au cinéma. Il est le conjoint de l'actrice Céline Bonnier.
Son interprétation d'Ovila Pronovost dans Les Filles de Caleb (1990-1991) en fait une vedette de la télévision québécoise. Fiction romanesque, cette série s'appuie sur une période historique importante du Québec et fut très populaire.
Par la suite, il enfile le plus grand succès critique dans les films Being At Home with Claude (1991), Séraphin : Un homme et son péché (2002), Mémoires affectives et Manners of Dying (2004), et Maurice Richard (2005). Il fait de même à la télévision : Scoop (1991-1995), Maurice Richard (1999) et La Femme Nikita (1997-2001).
En 2005 il a incarné le rôle de Detective Conk Adams dans le film That Beautiful Somewhere (2006), tourné à North Bay en Ontario.
En 2007, il interprète au grand écran le rôle du Lieutenant-général Roméo Dallaire dans le film Shake Hands with the Devil de
Roger Spottiswoode. Le tournage principal de ce film au sujet du Génocide au Rwanda à Kigali avait débuté en juin 2006 et le film a été lancé en salle le 28 septembre 2007.
L'année 2008 démarre avec le retour de Roy Dupuis sur les planches: après 14 ans d'absence, c'est en effet avec la pièce Blasted de Sarah Kane (traduite par Jean-Marc Dalpé et mise en scène par Brigitte Haentjens), qu'il renoue avec le théâtre aux côtés de Céline Bonnier et Paul Ahmarani.