Il fait ses classes au Conservatoire de Paris après un passage à La Roulotte, une compagnie dirigée par André Clavé. Il sort du Conservatoire avec le premier prix, puis entre à la Comédie-Française en 1942 pour jouer des rôles de jeune premier. Il y rencontre
Jean-Louis Barrault qui monte des pièces (Phèdre, Le Soulier de satin, ...)
Il rejoint Barrault fonde sa compagnie en 1946 avec
Renaud. Dans cette troupe, installée au Théâtre Marigny, il va connaître une très riche vie professionnelle et privée. Il y retrouve surtout
Simone Valère avec qui il avait joué en 1943 dans Le Voyageur de la Toussaint de Louis Daquin. Ce fut pour eux, dix années de succès, lors desquelles ils jouent dans Les Fausses Confidences, Intermezzo, Occupe-toi d'Amélie, La Cerisaie..., il connut aussi quelques échecs comme Bérénice et Le Songe d'une nuit d'été.
Après 1956, il rejoint la troupe du Théâtre de l'Odéon qui va sur décision du ministre de la Culture, André Malraux, être confié en 1959 à la compagnie Renaud-Barrault et renommé Théâtre de France. Il connaît un nouveau succès avec le Mariage de Figaro où il joue les deux rôles principaux, Figaro en province et le Comte Almaviva à Paris. Il connaît aussi le succès dans Il faut passer par les nuages de François Billetdoux.
Jean Desailly débute au cinéma dans des rôles de jeunes premiers un peu fades. Avec l'âge, il campe des rôles plus fouillés et cinq de ses prestations sont particulièrement remarquables :
- le mari impuissant et assassin de Maigret tend un piège (1958) où, dans une scène d'anthologie face à Jean Gabin (Maigret), il livre un portrait de psychopathe hallucinant ;
- il affronte à nouveau Jean Gabin dans le film de Denys de La Patellière Les Grandes Familles (1958), tiré du roman éponyme de Maurice Druon ;
- le commissaire, dans Le Doulos de Jean-Pierre Melville ;
- dans La Mort de Belle (1961) où, encore bien assis socialement, suspecté de meurtre, il devient assassin ;
- dans La Peau douce (1964) où il campe avec finesse et sensibilité un homme partagé entre une liaison adultère et son statut social.
Au début des années 1960, il joue pour la télévision dans Le Chevalier de Maison-Rouge qui fut une grand feuilleton populaire, ce qui lui permet de relancer sa carrière au cinéma qui lui offre alors quelques beaux rôles. Après août 1968, et la fin de la mainmise du couple Renaud-Barrault sur le Théâtre de l'Odéon, commencent pour le couple Desailly-Valère quelques années difficiles.
Dans les années 1970, ils prennent la direction successivement du Théâtre Hébertot (Le Légume, L'Amour fou), puis du Théâtre Edouard VII avant de prendre la succession d'André Bernheim au Théâtre de la Madeleine de 1980 à 2002. Il a souvent joué des rôles de bourgeois aisé.
En 1989, on le retrouve dans l'adaptation télévisée des Grandes Familles, où il joue le rôle de l'abbé Boudret, ami de la famille Schoudler-De la Monnerie.
En 2002, ils jouent leur ultime succès, La Maison du lac, une pièce d'Ernest Thompson, mise en scène par
Georges Wilson.
À sa mort, sa mémoire est saluée par le président
Nicolas Sarkozy qui rend hommage à « son immense talent au service d'auteurs dont il savait sublimer les textes » et par la ministre de la Culture Christine Albanel, qui évoque « un merveilleux acteur qui incarnait naturellement et à un degré supérieur, la distinction et « le charme discret de la bourgeoisie » dans chacun de ses rôles. » Il est inhumé à Vert-le-Petit (Essonne).