Issue d'une famille de classe moyenne, Lupe Ontiveros était un enfant d'un groupe d'immigrants mexicains, qui devinrent propriétaires d'une usine de tortillas et de deux restaurants à El Paso où ils emménagèrent. Par la suite, Ontiveros étudia à la Texas Woman's University, université pour femmes à Denton, Texas. Après leur mariage, Lupe Ontiveros et son mari, Elias Ontiveros, déménagèrent en Californie pour réaliser leur rêve, celui d'entreprendre une entreprise automobile. Alors qu'étant sur le point de retourner à l'université pour obtenir un diplôme d'infirmière, Ontiveros se lança dans la carrière de figurant après avoir lu un article de presse. Encouragé par son mari, elle postula, puis, s'intéressa davantage au métier du cinéma. À l'âge de 18 ans, elle travailla comme travailleur social où elle s'occupa de la prévention de la violence conjugale et la consciente et prévention du SIDA, parmi d'autres questions de santé. Ontiveros et sa famille composée de 3 enfants résident actuellement dans la ville de Pico Rivera.
Après avoir fait des apparences dans de nombreux films, elle eut un rôle plus important dans le film Au nord le paradis. Elle joua ensuite dans des films comme Rêves de famille ou
Selena où, dans ce dernier, elle interpréta l'assassin de la chanteuse Selena, Yolanda Saldívar ; Ontiveros est même parfois confondue avec cette dernière. En 2000, elle obtient un rôle principal dans le film Chuck&Buck où elle joua le rôle d'une directrice de théâtre exigeante. Dans de multiples interviews, elle dit avoir accepté le rôle dans avoir même lu le script, seulement par le fait que son personnage n'est pas d'ethnicité hispanique. Pour ce rôle, elle fut nominée aux Independent Spirit Awards. En 2002, elle joua dans le film Ana avec l'actrice America Ferrera où elle joua la mère très exigeante du personnage de cette dernière. Ses excellentes performances lui ont permis de co-présenter le festival du film de Sundance.
En 2005, Ontiveros a joué le rôle de Juania Solis, mère de Carlos Solis dans la série Desperate Housewives où elle suspecta sa belle-fille, Gabrielle Solis pour ses adultères. Lupe Ontiveros joua aussi dans Greetings from Tucson et plus anciennement, dans Les Dessous de Veronica où elle gagna un Alma Award en 1989, dans Pasadena, Capitaine Furillo, Red Shoe Diaries, Resurrection Blvd., King of the Hill parmi de nombreuses autres séries.
Avant de se lancer dans le cinéma, Ontiveros a fait une carrière d'actrice de théâtre pendant laquelle elle joua au très sérieux théâtre Nosotros de Los Angeles. En 1978, elle joua dans la pièce de théâtre Zoot Suit et y rejoua en 1982 pour l'adaptation en film. Elle est aussi l'un des fondateurs de la compagnie de théâtre, Latino Theater Company.