Margaret Sullavan est née à Norfolk en Virginie, de Cornelius Sullavan, riche agent de change et sa femme Garland, née Brooke. Elle fut pensionnaire à l'institut Chatham Episcopal, où elle était présidente du corps étudiant. Elle déménagea pour Boston où elle vécut avec sa demi-soeur, Weedie, et où elle s'impliqua dans le club théâtral d'Harvard, dont faisait également partie
Henry Fonda. Elle débute dans Close Up en 1929. Charlie Leatherbee et Josh Logan étaient dans le public et l'invitèrent à les rejoindre à Falmouth, dans le Massachusetts, une troupe universitaire. Elle joue dans leur première production, The Devil in the Cheese, ses débuts sur la scène professionnelle. Finalement elle est repérée par Lee Shubert pour sa première pièce à Broadway, A Modern Virgin (1931).
Sullavan arrive à Hollywood le 16 mai 1933, à son 22e anniversaire. Elle débute dans Only Yesterday. En 1938, elle est nommée à l'Oscar de la meilleure actrice pour son rôle dans
Trois camarades. Elle partage quatre fois l'affiche avec
James Stewart, (avec lequel elle et
Henry Fonda avaient créé une société anonyme avant d'être célèbres) : Next Time We Love (1936), The Shopworn Angel (1938), La Tempête qui tue et The Shop Around the Corner ( 1940). Ses autres films importants de cette époque étant : Et demain ? (1934), The Good Fairy (1935, réalisé par Wyler), L'Ensorceleuse (1938, avec
Joan Crawford), So Ends Our Night, Back Street, Appointment for Love (tous en 1941) et Cry 'Havoc' (1943).
Sa dernière prestation à l'écran date de 1950 avec le film No Sad Songs for Me réalisé par Rudolph Maté, écrit par
Howard Koch. Elle sort de sa retraite en 1952 pour le drame The Deep Blue Sea de
Terence Rattigan monté à Broadway, suivi l'année suivante par la comédie Sabrina Fair de
Samuel Taylor.
Elle apparaît également à la télévision dans Chevrolet Tele-Theater, Studio One, Magnavox Theater, et Schlitz Playhouse of Stars.
Elle a une étoile sur le Hollywood Walk of Fame au 1751 Vine Street.
Sullavan s'est mariée quatre fois:
- elle épouse Henry Fonda le 25 décembre 1931. Le mariage ne dure qu'un an, même si Sullavan et "Hank" sont restés des amis leur vie durant.
- son deuxième mariage avec le réalisateur William Wyler, fut aussi bref,
- son troisième mariage à l'agent et producteur Leland Hayward, dura onze ans. Ils eurent trois enfants : Brooke, né le 5 juillet 1937; Bridget, né en 1939; et William Leland, né en 1941. Sullavan et Hayward divorcent en 1947,
- trois ans plus tard, elle épouse Kenneth Wagg, jusqu'à sa mort.
Sullavan souffrait de dépression et d'une défaillance auditive congénitale de l'oreille gauche, l'otospongiose, qui empira avec l'âge la rendant de plus en plus sourde. Le 1er janvier 1960, elle est trouvée morte dans une chambre d'hotel à New Haven (Connecticut), d'une overdose de barbituriques. Elle avait 50 ans. (L'une de ses filles, Bridget Hayward, meurt neuf mois plus tard d'une overdose.)
Sa fille, l'actrice Brooke Hayward, a écrit Haywire, à propos de sa famille. Un livre qui a été adapté pour la télévision avec
Lee Remick.