Après des études à l'université de Fordham, puis à l'université Columbia, Robert Sean Leonard est accepté à la Screen Actors Guild. C'est là qu'il décide de changer son nom, remplaçant Lawrence par Sean, le nom de son frère.
Fort de son apprentissage, il obtient son premier rôle à la télévision en 1986. Il a un petit rôle dans My Two Love. La même année, on le voit aussi dans le film The Manhattan Project, un film de science-fiction. Robert Sean Leonard continue ainsi, de petits rôles en petits rôles, passant de Bluffing it en 1987, toujours à la télévision, à My best friend is a vampire, en 1988. C'est finalement l'année suivante, en 1989, qu'il obtient l'un de ses rôles les plus marquants, celui de Neil Perry Robert dans le film oscarisé Le Cercle des poètes Disparus, où il joue aux côtés de
Robin Williams et
Ethan Hawke. Ce dernier demeure d'ailleurs l'un de ses meilleurs amis. Dans ce film culte, Robert Sean Leonard campe un jeune étudiant passionné par la comédie, mais qui est brimé par son père, qui a d'autres projets pour lui.
Grâce à ce film, la carrière du jeune Robert Sean Leonard, tout juste âgé de 20 ans, est alors lancée. Il enchaîne ainsi les films avec en 1990, Mr et Mrs Bridge, avec
Paul Newman à l'affiche, nommé aux Oscars, Married to it en 1991 qui rencontre moins de succès. Puis Beaucoup de bruit pour rien, en 1993, réalisé par Kenneth Branagh, qui fut l'un des plus grands succès de film adapté d'une pièce de Shakespeare. Il y joue aux côtés de talents du cinéma comme
Keanu Reeves,
Denzel Washington,
Michael Keaton et
Emma Thompson. La même année, Robert Sean Leonard joue dans Le temps de l'innocence, avec
Daniel Day-Lewis,
Winona Ryder et
Michelle Pfeiffer entre autres. Là encore, c'est un film qui rencontre un beau succès et décroche une nomination aux Oscars. Dans la foulée, Robert Sean Leonard enchaîne sur Swing Kids, toujours la même année, et donne la réplique à
Christian Bale et
Kenneth Branagh, déjà rencontré sur le tournage de Beaucoup de bruit pour rien.
Après ces trois derniers grands films, la carrière de Robert Sean tourne au ralenti. Il continue malgré tout d'être présent au cinéma, notamment dans Killer : Journal d'un assassin en 1996, I Love you I love you not en 1996, puis
Les derniers jours du disco en 1998 et enfin Ground Control face à
Kiefer Sutherland en 1998.
Sa carrière dans le cinéma s'étant peu à peu éteinte, Robert Sean Leonard décide de se tourner vers la télé. Après quelques rôles et apparitions dans Outer Limits, Wasteland, les films Tape, A Glimpse of hell et Driven, Robert Sean trouve finalement le rôle de sa vie.
Il est ainsi le premier acteur à avoir intégré le casting de la série culte
Dr House. Il y incarne James Wilson, chef du service d'oncologie, et meilleur ami du Dr Gregory House. Ou plutôt la seule personne que Gregory House considère comme son ami. Face au caractère cynique de House, Wilson apparaît comme un être plus humain et généreux, qui tente jour après jour d'insuffler un peu à House de sa bonhomie, sans vrai succès. A noter que dans la vraie vie, Robert Sean Leonard et
Hugh Laurie, qui incarne Gregory House, sont de bons amis.
Robert Sean Leonard s'est marié en août 2008 avec Gabriella Salick. Leur fille Eleanor Blanche Leonard est née le 15 janvier 2009.