Ses parents ont divorcé quand elle avait 2 ans. Sa mère est agent immobilier à Atlanta et son père est conducteur de camions dans le Missouri.
Elle s'est mariée le 11 octobre 2003 avec l'acteur
Alexis Denisof, qui interprète le rôle de Wesley Wyndam-Pryce dans les séries télévisées Buffy contre les vampires (saison 3) et Angel. Dans le domaine des activités caritatives, elle est l'une des actrices porte-parole de la ligue américaine contre le cancer du sein.
Le 24 mars 2009, le jour de son propre anniversaire, Alyson donne naissance à Satyana, son premier enfant avec son mari
Alexis Denisof.
Elle a commencé sa carrière d'actrice en tournant des publicités dès l'âge de 4 ans à Atlanta. Elle a participé à plusieurs séries télévisées comme Roseanne. En 1989, elle joue le rôle d'une sorcière dans la série Free Spirit.
Elle s'est surtout fait connaître pour son rôle de Willow Rosenberg, une sorcière lesbienne, dans la série Buffy contre les vampires.
Elle porte des tatouages représentant des figurations tribales de dauphins sur sa cheville, et un kanji japonais, symbolisant la chance et le bonheur, dans son dos.
Alyson Hannigan a participé aux trois comédies à succès de la série de films
American Pie 1,
2 et 3 dans le rôle de Michelle Flaherty.
En 2005, elle a joué le rôle principal de la comédie musicale
Quand Harry rencontre Sally (adaptée du film) avec
Luke Perry (qui a joué dans Beverly Hills 90210 ainsi que dans le film Buffy à l'origine de la série).
Depuis 2005, elle figure également au générique d'une sitcom, How I Met Your Mother, diffusée sur CBS, dans laquelle elle retrouve un rôle comique.
Elle a aussi joué dans la série américaine That 70's show dans le rôle de Susie Simpson, une policière qui collabore avec Michael Kelso.