Dernier né d'une famille de 17 enfants, il entame, après des études au petit séminaire du Pont-de-Beauvoisin (Savoie), sa carrière théâtrale à Paris en 1903, est engagé au théâtre des Gobelins et au Lapin agile. Il entre en 1906 au théâtre de l'Odéon dirigé par André Antoine, crée sa compagnie en 1908, puis intègre le théâtre des Arts en 1910 sous la direction de Jacques Rouché. Là, il reçoit les éloges des critiques pour son jeu dans Les Frères Karamazov mis en scène par
Jacques Copeau en 1911. Quand ce dernier crée le théâtre du Vieux Colombier en 1913, il le suit et devient son bras droit. Après la guerre, qu'il fait comme engagé volontaire, il continue l'aventure avec Copeau, au Garrick Theater de New York, puis travaille avec Firmin Gémier.
Il forme sa propre équipe en 1921 sous le nom d'Atelier, où il transmet les leçons reçues de Copeau : formation des comédiens et priorité du texte. Il monte des auteurs contemporains et étrangers, comme Luigi Pirandello,
Marcel Achard,
Armand Salacrou, sans exclure les classiques tel Shakespeare ou Aristophane, et rencontre des succès critiques grâce aux mises en scène de Volpone de Ben Jonson (1928, adapté par Jules Romains et Stefan Zweig) et de L'Avare de Molière. Avec
Louis Jouvet, Gaston Baty et Georges Pitoëff en 1927, il fonde le « Cartel des Quatre », visant à faire entendre le théâtre non mercantile. Entre 1940 et 1947, il est directeur du Théâtre de la Cité (ancien Théâtre Sarah-Bernhardt, actuel Théâtre de la Ville, où il monte Les Mouches de
Jean-Paul Sartre en 1943. Il rejoint ensuite l'équipe du théâtre Montparnasse, dirigé par une de ses anciennes élèves de l'Atelier,
Marguerite Jamois.
Avec le Cartel des Quatre et aux côtés d'André Barsacq,
Jean-Louis Barrault et
Jean Vilar, Dullin a fait partie du mouvement de renouvellement français qui aboutira à un « théâtre décentralisé populaire ». Réputé pour la qualité de ses cours, à base d'improvisation, de mime et d'étude des classiques, il a eu entre autres pour élèves
Madeleine Robinson,
Jean Marais,
Marcel Marceau,
Jean Vilar,
Jean-Louis Barrault,
Roger Blin,
Roland Petit,
Jacques Dufilho, Georges Vandéric et
Alain Cuny.