En 1984, Jane Birkin, en tournage sur La Pirate de Jacques Doillon, incite sa fille à passer le casting d'Élie Chouraqui pour Paroles et musique. Elle obtient ainsi son premier rôle à l'âge de treize ans. L'année suivante, Jacques Doillon lui offre quelques répliques dans La Tentation d'Isabelle qui lui vaut d'être remarquée par Claude Miller. Ce dernier va lui offrir un des principaux rôles de son film L'Effrontée. Sa performance lui vaut alors le César du meilleur espoir féminin en 1986. Elle travaille ensuite avec son père (
Charlotte for Ever en 1986), puis avec sa mère (Kung Fu Master ! en 1987). En 1988, Claude Miller fait de nouveau appel à elle pour La Petite Voleuse d'après un scénario de François Truffaut.
Mais c'est seulement avec Merci la vie de Bertrand Blier que Charlotte décide de faire carrière dans le cinéma : « C'est vraiment là que j'ai décidé de continuer à faire ce métier. Avant, je me cachais derrière des prétextes. Je voulais faire bonne figure. Et si on n'allait plus me proposer de rôles ? Cela me terrifiait. Alors je préférais raconter que je ne savais pas si j'allais poursuivre dans cette voie. » (Le Figaro, 23 juin 1996). Paradoxalement, c'est à ce moment-là que sa carrière semble stagner, malgré ses retrouvailles avec Jacques Doillon dans le rôle principal de Amoureuse. Sa carrière redémarre à partir de 2001 avec les deux films de son mari Ma femme est une actrice et Ils se marièrent et eurent beaucoup d'enfants ainsi qu'au niveau international avec
21 grammes où elle joue aux côtés de Sean Penn, ou encore dans I'm not there sur la vie du chanteur folk Bob Dylan.
En 2003, elle devient l'égérie de la marque Gérard Darel.
Dans la nuit du 5 au 6 septembre 2007, elle est opérée d'urgence d'une hémorragie cérébrale, suite à un accident de jet-ski.
Elle préside la 34e cérémonie des César animée par Antoine de Caunes le 27 février 2009 aux côtés de Sean Penn.
Elle reçoit lors du festival de Cannes 2009 le Prix d'interprétation féminine pour son rôle dans
Antichrist de
Lars Von Trier.
En mai 2010 sort une bande dessinée sur Charlotte : Charlotte Gainsbourg mon amour aux éditions Delcourt. Un hommage humoristique du dessinateur Fabrice Tarrin qui la représente sous les traits d'un petit canard à la mâchoire prognathe.
Le 23 mai 2010, c'est Charlotte Gainsbourg qui remet la Palme d'or du 63e Festival de Cannes au réalisateur thaïlandais Apichatpong Weerasethakul pour le film
Lung Boonmee raluek chat. Elle a déclaré lors d'une interview a propos de son physique:" Ma mâchoire prognathe vient de mon père alcoolique et ma taille, de ma mère mannequin"