Fils du réalisateur Marino Girolami, il effectue des petits rôles en tant qu'acteur dès l'âge de six ans. Il étudie ensuite à l'Université de Rome et devient diplômé d'architecture, puis exercera de nombreux métiers de l'industrie cinématographique: assistant de production, scripte, scénariste...
En 1966, il assiste
Leon Klimovsky dans la réalisation de Pochi dollari per Django, un western spaghetti avec Anthony Steffen. Un an plus tard, il réalise son premier film entièrement à son nom et connaît un franc succès public et critique avec Je vais, je tire et je reviens. Il réalise ensuite quatre westerns spaghetti dans la foulée, dont une suite non-officielle de
Django.
En 1969, son cinquième film, Sur ordres du Führer, mobilise d'importants moyens techniques tels que des avions et des véhicules blindés ainsi que des stars du moment comme
Luigi Pistilli. Le film est un succès et le fait connaître à l'étranger.
En 1976, alors que les westerns spaghetti sont considérés comme démodés, Castellari réalise Keoma, une sorte de film-testament qui laissa un temps supposer un retour en force du genre mais ne fut qu'une réussite isolée.
Les années 1980 marquent des collaborations avec la télévision ainsi que Les Guerriers du Bronx, un drame social qui témoigne d'une distance prise avec son genre de prédilection. Mais il y revient en 1993 avec Jonathan degli orsi, un western tourné dans une base soviétique en Sibérie qui nécessita la reconstitution d'un village indien.
En 1997, il tourne une série en trois épisodes intitulée Le Désert de feu, où figurent d'immenses stars du cinéma telles que
Claudia Cardinale,
Alain Delon,
Vittorio Gassman,
Franco Nero ou
Giuliano Gemma. Gli Angeli dell'isola verde, un western moderne réalisé en 2001 mais non diffusé à l'étranger, est son dernier film. On le retrouve dans le rôle d'un officier nazi dans Inglorious Basterds de
Quentin Tarantino, lequel a souhaité lui rendre hommage.